目的:探讨嗜肺军团菌重组鞭毛蛋白(recombinant flagellin A,rflaA)、重组巨噬细胞增强蛋白(recombinant macrophage inflammatory protein,rmip)对小鼠RAW264.7细胞功能影响及其NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、核苷酸结合寡聚化结构域受体1(Nucleotide-binding Oligomerization Domain1,NOD1)、核苷酸结合寡聚化结构域受体2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain1,NOD2)是否参与分泌细胞因子功能初步研究。方法:1.实验分组:采用(0.00、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000)μg/m L rflaA、(0、0.067、0.136、0.271、0.542、1.084、2.168、4.335)μg/mL rmip处理RAW 264.7细胞,并设立细胞对照组,采用CCK-8法确定rflaA、rmip半数效应剂量(median effective concentration,EC50)。按照EC50测定剂量分别稀释1/5、1/10、1/20进行实验分组,(0.04μg/mL rflaA低剂量组、0.08μg/m L rfla A中剂量组、0.16μg/mL rflaA高剂量组)rflaA及(0.02μg/mL rmip低剂量组、0.04μg/mL rmip中剂量组、0.08μg/mL rmip高剂量组)rmip处理RAW 264.7细胞,并设细胞对照组。2.细胞活性测定:将倍比稀释的rflaA、rmip分别作用RAW 264.7细胞24、48、72h,用cck8法检测细胞活性。3.用不同剂量rflaA、rmip处理RAW 264.7细胞作用24h,检测趋化功能;收集细胞上清液,ELISA检测RAW 264.7细胞分泌趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage Migration Inhibitory Factor,MIF)的分泌水平。4.用不同剂量rflaA、rmip处理RAW 264.7细胞作用6、12、24、36、48 h,收集细胞,采用qrt-pcr法检测mcp-1、mif的mrna含量。5.用不同剂量rflaa、rmip处理raw264.7细胞作用24、48、72h检测细胞吞噬功能。6.分别收集24、36、48h细胞上清液,采用elisa检测raw264.7细胞分泌白细胞介素-6(interleukin-6,il-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1beta,il-1β)、白细胞介素-1α(interleukin-1α,il-1α)、白细胞介素-10(interleukin-10,il-10)。7.用不同剂量rflaa、rmip处理raw264.7细胞作用6、12、24、36、48h,收集细胞,采用qrt-pcr法检测il-6、il-1β、il-1α、il-10、干扰素-r(lnterferongamma,ifn-r)、肿瘤坏死因子a(tumornecrosisfactor,tnf-a)、nlrp3、nod1、nod2、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(thereceptor-interactingserin-threonineproteinkinase2,rip2)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(cysteinylaspartate-specific-1,casp-1)mrna含量。采用westernblot法检测nod1、nod2、rip2、nlrp3、casp-1蛋白表达水平。统计学分析用graphpadprism5.0软件计算rflaa、rmip重组蛋白的ec50;计量资料数据采用x±s表示,多组不同时间数据比较方差分析,采用spss19.0统计学软件分析,p<0.05为差异有统计学意义。结果:1.细胞活性检测:结果显示,raw264.7细胞的活性随着rflaa、rmip剂量的增加而活性降低。有显著差异性(p<0.01),随着rflaa、rmip剂量的增加,raw264.7细胞的活性降低,有显著差异性(p<0.01),24h优于其它时间段,不同时间存在交互效应(p<0.05)最大值在孵育24h,最小值在孵育72h。用graphpadprism5.0软件计算rflaa蛋白的ec50,rflaec50剂量0.8μg/ml,rmipec50剂量0.43ug/ml。2.rflaa、rmip促进raw264.7细胞的mcp-1、mif分泌。不同剂量rflaa、rmip作用raw264.7细胞24h后,mcp-1、mif分泌能力随重组蛋白剂量增加而增加,尤以高剂量时增加明显,与对照组及其它分组均有差异性(p<0.05)。3.rflaa、rmip促进raw264.7细胞mcp-1、mifmrna水平表达,不同剂量rflaa、rmip作用RAW 264.7细胞6、12、24、36、48h后,随剂量增加促进MCP-1、MIF分泌,以高剂量时分泌水平增加明显,12h时分泌水平达到峰值。随着作用时长增加有下降趋势,与对照组及其它分组均有差异性(P<0.05)。4.rflaA、rmip作用RAW 264.7细胞,其吞噬功能减弱,不同剂量rfla A、rmip作用RAW 264.7细胞24h、48、72h后,随重组蛋白增加吞噬功能下降,与对照组均有差异性(P<0.05)。5.不同剂量的rflaA、rmip作用RAW 264.7细胞24、36、48h后,随着重组蛋白剂量的增加分泌增加,RAW 264.7分泌细胞因子IL-6、IL-1β、IL-1α、IL-10增加,以高剂量增加明显,36h分泌达峰值,随着作用时长延长有下降趋势,与对照组均有差异性(P<0.05)。6.不同剂量的rflaA、rmip作用RAW264.7细胞6、12、24、36、48h后,随着重组蛋白剂量的增加分泌增加,RAW 264.7细胞IL-6、IL-1β、IL-1α、IL-10、IFN-γ、TNF-α、NOD1、NOD2、RIP2、NLRP3、CASP-1mRNA表达水平增加,以高剂量表达水平增加明显,12h时表达水平达到峰值,随着作用时长增加有下降趋势,与对照组及其它分组均有差异性(P<0.05)。7.不同剂量的rflaA、rmip作用RAW 264.7细胞6、12、24、36、48 h后,随剂量增加NOD1、NOD2、RIP2、NLRP3、CASP-1表达水平,以高剂量蛋白表达量增加明显,24h达峰值,随着作用时长表达量有下降趋势,与对照组及其它分组有差异性(P<0.05)。结论:1.rflaA、rmip增加巨噬细胞趋化功能及细胞因子分泌,下调其吞噬能力。2.rflaA可以促进巨噬细胞因子分泌,可能与NLRP3、CASP-1调控有关。3.rmip可以促进巨噬细胞因子分泌。可能与NOD1、NOD2、RIP2调控有关。