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1背景阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease, AD),又称“老年性痴呆”,是一种以近事记忆力下降,空间、语言和行为障碍,或可伴有抑郁及其它人格改变的中枢神经退行性病交,属于中医“呆病”的范围。到目前为止,AD的发病机制尚不清楚,但其主要的病理特征可包括：神经纤维缠结(neuron fibrillary tangles, NFTs),由tau蛋白在细胞内异常聚集而成；老年斑(senile plaques, SP),由β淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)在细胞外大量沉淀所形成；神经元的丢失。2目的本研究拟以国际上公认的SAMP8快速老龄化痴呆小鼠模型,从中医整体观基础理论出发,选取与AD神经元生存与凋亡密切相关的PI3K/AKT信号转导通路,探讨不同电针神经元保护的疗效差异,寻找针刺抗痴呆的新靶点,进一步揭示音乐电针治疗老年性痴呆的可能作用机制,为临床治疗AD提供一定的理论依据。3研究方法选用8月龄,雄性,SAMR1正常老化小鼠10只；SAMP8快速老龄化小鼠60只,随机分为模型组、非穴位组、音乐组、盐酸多奈哌齐组、脉冲电针组和音乐电针组(n=10)。脉冲电针组,针柄连接HANS-LH202型电针仪,选取“百会”、“印堂”,“人中”点刺放血,20min/日,共15天；非穴位组,在小鼠尾部距尾根1/3处给予同样的刺激。音乐电针组,选取与脉冲电针组小鼠相同的穴位,采用抗痴呆的音乐处方,针柄连接ZJ-12H音乐电针仪。音乐组,在音乐电针组干预时抓取一次,同时和音乐电针组聆听音乐,以保证处理条件相同。多奈哌齐组,采用灌胃给药15天。正常组和模型组均不给予治疗,只是在其他治疗组干预的同时抓取1次。15天后,采用mirrors水迷宫对各组小鼠进行行为学评价。采用尼氏染色和苏木精-伊红染色观察每组小鼠海马CA1区神经元的数目和组织形态的病理改变；采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测每组小鼠血清中Aβ40和Aβ42蛋白水平表达情况；采用免疫组化、western bolt和Real-time PCR检测各组小鼠海马Tau、P-Tau(serl99/202)、AKT、P-AKT(ser473)、GSK-3p、P-GSK-3p(ser9)和GFAP蛋白和基因表达水平。4研究结果(1)Morris水迷宫试验结果显示：与SAMR1正常老化小鼠相比,SAMP8模型小鼠学习记忆能力明显降低,表现为逃避潜伏期延长、游泳距离增加、跨平台次数减少和目标象限停留时间缩短(P<0.01)；与SAMP8模型组小鼠相比,非穴位组学习记忆能力与之相当,无统计学差异(P>0.05)；音乐组小鼠的逃避潜伏期时间和游泳距离有下降趋势,穿越平台次数有增多趋势,目标象限停留时间有延长趋势,但无统计学差异(P>0.05)；盐酸多奈哌齐组、脉冲电针组和音乐电针组小鼠学习记忆能力显著改善,这反映在逃避潜伏期和游泳距离减少(P<0.05)、跨平台次数和目标象限停留时间频率增加(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。(2)光镜下,各组小鼠HE染色的结果显示：SAMP8模型组中,海马CA1区的细胞排列紊乱,细胞层数显著减少,细胞核仁不清楚,可有核固缩的现象；非穴位组和音乐组小鼠海马CA1区细胞排列错乱,神经元明显丢失,细胞层数减少；盐酸多奈哌齐组、脉冲电针组和音乐电针组小鼠海马CAI区细胞排列较为规则整齐,核仁清晰呈圆形或椭圆形,细胞层数较模型组明显增加。(3)各组小鼠尼氏染色结果表明：与SAMRl正常老化小鼠对比,SAMP8模型组小鼠海马CA1区尼氏体浅染,神经元胞体形态排列不规则,尼氏体数量明显减少(P<0.01)。与SAMP8模型组相比,非穴位组和音乐组小鼠海马CA1区神经元数量和病理形态改变相似；盐酸多奈哌齐组、脉冲电针组和音乐电针组小鼠均能改善SAMP8小鼠海马CA1区神经元减少和丢失现象,起到保护神经元的作用。(4)酶联免疫吸附(ELISA)结果表明：与SAMR1正常老化小鼠相比,模型组小鼠血清A β40和A β42蛋白表达均显著增高(P<0.01)。与SAMP8模型组相比,非穴位组血清Aβ蛋白表达相似,无显著差异(P>0.05),音乐组血清Aβ蛋白表达呈减少趋势,但仍无显著差异(P>0.05)；盐酸多奈哌齐组、脉冲电针组和音乐电针组小鼠血清A β40降低,有统计学差异(P<0.05)；三组在降低A β42蛋白水平上有显著性差异(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。与脉冲电针组相比,音乐电针组小鼠血清中A β42蛋白水平显著下降,有统计学差异(P<0.05)。(5)不同电针干预SAMP8小鼠海马P13K/AKT信号转导通路的影响：1)免疫组织化学法(HIC)：总AKT和总GSK-3p蛋白含量在各组小鼠海马内变化不大,无显著差异(P>0.05)。与正常SAMR1小鼠相比,SAMP8模型小鼠P-AKT(ser473). P-GSK-3β(ser9)蛋白表达均减少(P<0.01)；与SAMP8模型小鼠比较,非穴位组和音乐组P-AKT(ser473). P-GSK-3β(ser9)蛋白表达无显著性差异(P>0.05)；盐酸多奈哌齐组、脉冲电针组和音乐电针组小鼠海马P-AKT(ser473)、P-GSK-3β(ser9)蛋白增高(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。2)Western bolt结果显示：与免疫组化结果一致。3)Real-time PCR结果显示：与正常组比较,模型组小鼠海马AKT mRNA和GSK-3β mRNA表达显著性降低(P<0.01)；非穴位组AKT mRNA和GSK-3β mRNA表达较SAMP8模型组无显著性差异(P>0.05)；音乐组该基因表达有上升趋势,但无统计学差异(P>0.05)；盐酸多奈哌齐组、脉冲电针组和音乐电针组均能一定程度上改善小鼠海马AKT mRNA和GSK-3β mRNA的基因表达,有统计学差异(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。(6)对比不同电针干预SAMP8小鼠海马tau蛋白表达水平的影响：1)免疫组织化学法(HIC)：总Tau蛋白在各组小鼠海马内无统计学差异(P>0.05)。与正常组相比,模型组小鼠海马P-Tau(ser199/202)蛋白表达显著增多,有统计学差异(P<0.01)。与模型组相比,非穴位组和音乐组小鼠海马P-Tau(serl99/202)蛋白表达无显著变化(P>0.05);盐酸多奈哌齐组、脉冲电针组和音乐电针组均能降低SAMP8小鼠海马P-Tau(ser199/202)蛋白含量(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。2)Western bolt和Real-time PCR结果显示：各指标表达趋势同免疫组化。(7)对比不同电针干预SAMP8小鼠海马星形胶质细胞GFAP的影响：1)免疫组织化学法(HIC)：与SAMR1正常小鼠比较,GFAP蛋白在SAMP8模型组小鼠海马区表达显著增加(P<0.01)。与模型组小鼠相比,非穴位组和音乐组GFAP表达无统计学差异(P>0.05)；盐酸多奈哌齐组、脉冲电针组和音乐电针组均能明显降低SAMP8小鼠海马GFAP蛋白含量,有统计学差异(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。2)Western bolt和Real-time PCR结果显示：各指标表达趋势同免疫组化。5结论(1)SAMP8快速老化痴呆小鼠存在着明显的学习记忆认知障碍,并且也出现了tau蛋白和Ap蛋白明显增加的病理表现,同时还伴随着神经元的损伤和减少,是AD的理想模型之一。(2)电针能较好的保护小鼠海马神经元,脉冲电针和音乐电针可改善痴呆小鼠神经元的丢失；在提高海马CA1区神经元的数量以及改善SAMP8小鼠神经元损伤方面,音乐电针优于脉冲电针。(3)电针可明显改善SAMP8快速老化小鼠学习记忆认知障碍,其中在改善认知障碍方面,音乐电针组仅有优于脉冲电针组的趋势,无统计学差异;但其在学习记忆力保持方面优于脉冲电针。(4)电针抗痴呆的作用机制之一可能是通过PI3K/AKT信号转导通路的上调,增加AKT的活性,促进GSK-3p (ser9)磷酸化,从而抑制GSK-3β活性,进而降低Aβ蛋白的沉积和tau蛋白过度磷酸化,最终达到减少神经毒性,保护神经元的目的。其中,音乐电针在调节PI3K/AKT信号转导通路的关键蛋白方面优于脉冲电针。(5)在改善SAMP8小鼠海马内星形胶质细胞GFAP表达方面,音乐电针能明显减少其表达,抑制炎症因子的释放,减轻神经元的损伤,且明显优于脉冲电针组,这可能是音乐电针抗老年痴呆症的机制之一。