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癫痫是神经系统常见的临床综合征，慢性、突发性和反复刻板发作为其主要临床特点。尽管新抗癫痫药(antiepileptic drugs，AEDs)不断问世，但仍有30％患者的发作不能控制，成为难治性癫痫。这部分患者多为复杂部分性发作(多见于成人)和各种癫痫综合征(多为儿童)，不仅对常规AEDs的反应较差(具有耐药性)，即使是新型AEDs对这部分癫痫患者的疗效也不十分肯定。大量研究表明由于癫痫源性脑组织的血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)上具有药物外排作用的多药转运体(multidrug transporters，MDTs)的过度表达，限制了脑组织对AEDs的摄取，影响了药物到达作用靶点而形成耐药。癫痫发作可引起MDTs的过度表达，癫痫发作又引起谷氨酸释放增加，谷氨酸通过活化NMDA受体上调大鼠脑微血管内皮细胞P-gp的表达，提示癫痫发作后MDTs的过度表达可能与NMDA受体的活化有关，我们首先观察边缘叶癫痫发作大鼠模型癫痫持续状态(status epilepticus，SE)后72 h内海马MDTs的表达变化；然后分别在SE后MDTs mRNA和蛋白表达最高时点观察NMDA受体拮抗剂MK801对MDTs表达的影响；最后在细胞水平观察谷氨酸刺激对大鼠脑微血管内皮细胞(rat brain microvessel endothelial cells，RBMECs)mrp2 mRNA表达和外排功能的影响，以及MK801预处理后对谷氨酸作用的影响。第一部分多药转运体在边缘叶癫痫发作后的动态表达变化目的：探讨SE终止后72 h内P-gp、Mrp2、Bcrp表达的时间规律，明确MDTs表达的细胞类型分布。材料与方法：制备氯化锂—匹罗卡品癫痫发作大鼠模型，用实时荧光定量RT-PCR法检测SE终止后0h、3h、6h、24h、72h和control组海马组织P-gp、Mrp2、Bcrp、Ralbpl、Pxr的mRNA表达；Western blot检测SE终止后3h、6h、24h、72h和control组海马组织P-gp、Mrp2、Bcrp的蛋白表达；免疫荧光检测SE终止后24h和对照组P-gp、Mrp2、Bcrp分别与vWF、MAP2、GFAP双标染色，以上各组每组6只大鼠。结果：SE终止后72h内P-gp、Mrp2、Bcrp mRNA和蛋白表达均先升高后降低，3种MDTs mRNA表达均在SE终止后6h最高(6h时mdr1b mRNA的平均拷贝数为36148.8，3种MDTs mRNA的表达与control相比，P＜0.01)，蛋白表达均在24 h时最高(Mrp2平均相对光密度值为0.27，3种MDTs与control相比，P＜0.01)，Pxr mRNA的表达在3 h时最高(平均mRNA拷贝数为136066.7，与control相比，P＜0.01)。正常对照组3种MDTs均只在毛细血管内皮细胞表达，SE终止后24 h，3种MDTs在神经元和星形胶质细胞上亦有少量表达。结论：癫痫发作诱导P-gp、Mrp2、Bcrp暂时性过度表达，癫痫发作可诱导神经元和星形胶质细胞表达以上3种MDTs。第二部分谷氨酸NMDA受体拮抗剂MK801对癫痫发作后多药转运体P-gp、Mrp2、Bcrp表达的影响目的：观察NMDA受体对边缘叶癫痫大鼠发作后P-gp、Mrp2、Bcrp表达的影响，探讨NMDA受体是否能对癫痫发作后上述3种MDTs的表达进行调控。材料与方法：动物共分为3组：control、MK801和SE组，SE组即氯化锂—匹罗卡品癫痫发作大鼠模型组，MK801组即SE组加MK801(0.5 mg／kg)预处理组，control组即除匹罗卡品改用生理盐水代替外，其他给药同SE组。使用实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测P-gp、Mrp2、Bcrp mRNA(SE终止后6 h)和蛋白(SE终止后24 h)表达，使用免疫组化检测SE终止后24 h时上述3种MDTs的表达分布。结果：SE组P-gp、Mrp2、Bcrp mRNA和蛋白表达均较control组明显升高(与control组相比，除mdr1a P＜0.05，其他均为P＜0.01)，MK801组上述MDTs的表达均较SE组明显下降，MK801组除Mrp2蛋白表达仍明显高于control组外，其他MK801各组mRNA和蛋白表达均与control组无统计学差异。免疫组化显示：SE组边缘系统脑区和大脑皮层P-gp的表达(阳性面积百分比和累积光密度值)明显高于control组和MK801组，后两者无统计学差异；除杏仁核外，SE组其他边缘系统和大脑皮层Mrp2的表达较control组明显增高(阳性面积百分比)，MK801组除梨状皮质明显高于control组外，其他脑区与control组相比无统计学差异；SE组边缘系统脑区和大脑皮层Bcrp的表达明显高于control组，除海马齿状回区MK801组较SE组Bcrp表达无差异外，MK801组其他脑区Bcrp的表达较SE组明显下降，并且MK801组与control组各脑区Bcrp的表达无差异。结论：NMDA受体拮抗剂MK801能逆转癫痫发作后P-gp、Mrp2、Bcrp的过度表达，NMDA受体的活化参与介导癫痫发作后P-gp、Mrp2、Bcrp的过度表达。在边缘脑区和大脑皮层中，SE组上述3种MDTs表达较control组明显增加，大多MK801组明显低于SE组，并与control组表达水平相当。第三部分谷氨酸、NMDA受体拮抗剂MK801对大鼠脑微血管内皮细胞mrp2 mRNA表达和外排功能的影响目的：观察谷氨酸对RBMECs上mrp2 mRNA表达和外排转运功能的影响，探讨NMDA受体是否影响谷氨酸刺激RBMECs后mrp2 mRNA和外排转运功能的变化。材料与方法：分离2周龄SD大鼠的大脑皮层微血管段，并进行原代RBMECs培养。待RBMECs生长至融合后，进行以下实验。MTT法检测不同浓度谷氨酸刺激对RBMECs活力的影响，细胞分组：control组，不给任何特殊处理；Glu组，给100μM谷氨酸刺激30 min后吸去上清，再培养24 h；MK801组，加入谷氨酸前，用100μM MK801预处理15 min，其他处理同Glu组。实时荧光定量RT-PCR检测mrp2 mRNA的表达。底物外排实验检测不同干预对RBMECs上Mrp2外排转运功能的影响。结果：MTT法结果显示300μM及其以上浓度的谷氨酸可明显引起RBMECS活力的下降，选择相对浓度较高，但又无明显影响RBMECs活力的谷氨酸浓度100μM，实时荧光定量RT-PCR结果显示，100μM谷氨酸刺激后，RBMECs上mrp2 mRNA的表达明显高于control组和MK801组(P＜0.05)，control组和MK801组比较无差异(P＞0.05)。底物外排实验结果表明Glu组胞外／胞内荧光强度比值明显高于control组和MK801组(分别为P＜0.05)，MK801组与control组比较无统计学差异(P＞0.05)。结论：谷氨酸刺激RBMECSs可诱导mrp2 mRNA表达和外排转运功能的增强，NMDA受体的拮抗剂可完全逆转谷氨酸的这一作用。结论1、癫痫发作诱导P-gp、Mrp2、Bcrp暂时性过度表达，癫痫发作可诱导神经元和星形胶质细胞表达以上3种MDTs。2、NMDA受体拮抗剂MK801能逆转癫痫发作后P-gp、Mrp2、Bcrp的过度表达，NMDA受体的活化参与介导癫痫发作后P-gp、Mrp2、Bcrp的过度表达。3、谷氨酸刺激RBMECSs可诱导mrp2 mRNA表达和外排转运功能的增强，并且NMDA受体的拮抗剂MK801可以逆转谷氨酸的这一作用。