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研究目的研究微小RNA(microRNA,miRNA)在食管鳞癌及其癌前病变患者血清中的表达情况,探索其作为初筛标志物的可行性。材料和方法1.筛选阶段:收集食管鳞癌患者血清,开展血清差异miRNAs筛选,miRNAs芯片检测及结果分析由上海生物芯片有限公司完成。芯片杂交原始数据经均一化和对数转换后进行差异显著性分析,选取差异倍数(Fold Change,FC)绝对值>2(上调)或者<0.5(下调)的miRNAs,结合文献报道有生物学功能的作为候选差异miRNAs。2.验证阶段:选取食管鳞癌患者及癌前病变患者血清开展验证,同时收集危险因素暴露及临床相关信息。采用qRT-PCR技术检测miRNAs的表达水平。将原始数据取3次重复的平均值,以miR-1228为内参,进行归一化,使用定量PCR中的相对定量法,得出△Ct,miRNAs表达量用2-△Ct表示。3.实时定量PCR数据用SPSS 22.0软件进行统计分析。首先进行描述性分析,计算一般人口学资料主要指标,对其进行均衡性检验,对于计数资料对比采用χ2检验,正态性计量资料采用t检验或方差分析。miRNAs表达量数据为非正态数据,通过SPSS正态得分对miRNAs表达量数据进行正态转化,正态转化前miRNAs表达水平以“p50(p25,p75)”形式置于表中,正态转化后数据以“均数±标准差”形式置于表中。应用多元logistics回归分析方法分析组间miRNAs的差异表达,以“组别”为因变量,“组间差异因素”及各miRNAs表达量正态转换值为自变量,采用逐步向前法,分析组间miRNAs差异表达,同时筛选自变量。所筛选的差异自变量应用于后续构建多变量观察值ROC曲线。应用二元logistics回归模型及ROC曲线进行多变量(多项测量指标)观察值的ROC曲线分析。采用逐步向前法,将多元logistics回归分析阶段筛选的差异自变量纳入二元logistic回归模型,计算求出预测值概率,将此概率纳入ROC模型,绘制受试者工作特征曲线(ROC),计算曲线下面积(AUC),AUC:0.5-0.7,较低准确性;AUC:0.7-0.9,有一定准确性;AUC>0.9,较高准确性;AUC=0.5,无诊断价值。根据ROC曲线确定临界值,并根据临界值确定其灵敏度(Sen)、特异度(Spe)。比较单项miRNA指标与联合miRNAs指标的诊断效能。同时,将总体分为试验组与验证组,分别计算并对比其诊断价值,评估miRNAs诊断价值稳定性。采用双侧检验,检验水准为 α=0.05。研究结果1.miRNAs 芯片筛选出 7 个候选差异miRNAs:miR-451a、miR-638、miR-486-5p、miR-16-5p、miR-92a-3p、miR-197-5p、miR-320c。本研究在人群验证 miR-320c、miR-451a、miR-486。2.食管鳞癌组、异型增生组及对照组两两组间血清miR-320c均差异表达,miR-320c在食管鳞癌组及异型增生组血清中高表达,且异型增生组中miR-320c表达水平高于食管癌组;异型增生组血清miR-451a、miR-486分别与食管鳞癌组、对照组间差异表达,且miR-451a、miR-486在异型增生组血清中高表达。食管癌组、异型增生组组内比较结果:食管癌患者不同发病部位、TNM分期、分化程度、病变分型组间血清miR-320c、miR-451a、miR-486差异表达无统计学意义;各级别异型增生组间血清miR-320c、miR-451a、miR-486表达也无统计学差异。3.总体血清miR-320c在食管癌组与对照组间诊断食管癌患者的ROC曲线下面积AUC为0.867(0.813-0.922)。当临界值取0.56时,灵敏度为81.3%,特异度为80.8%。总体血清miR-320c、miR-451a、miR-486单项或联合应用均可在异型增生组与对照组间诊断异型增生患者,血清miR-320c与三种miRNAs联合诊断价值相对较高,血清miR-320c诊断ROC曲线下面积AUC为0.785(0.716-0.854),当临界值取0.56时,灵敏度为70.7%,特异度为79.5%。三种miRNAs联合诊断ROC曲线下面积AUC为0.782(0.713-0.852)。当临界值取0.56时,灵敏度为70.7%,特异度为78.2%。总体血清miR-320c、miR-451a、miR-486单项或联合应用均可在食管癌组与异型增生组间诊断食管癌患者,三种miRNAs联合诊断ROC曲线下面积最高,诊断准确性最好,且具有较高诊断价值,其ROC曲线下面积AUC为0.813(0.753-0.872)。当临界值取0.49时,灵敏度为78.1%,特异度为70.7%。结论1.血清miR-320c、miR-451a、miR-486单项或联合应用可区分食管鳞癌组、异型增生组与对照组;2.血清miR-320c、miR-451a、miR-486单项或联合应用对食管癌及其癌前病变具有较好诊断价值,准确性较高,且具有稳定性,可作为初筛的潜在应用指标;3.未发现血清miR-320c、miR-451a、miR-486差异表达与肿瘤患者发病部位、TNM分期、分化程度、病变分型及各级别异型增生之间的关联,仍需更大样本量的深入探讨;