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白地霉脂肪酶(Geotrichum candidum lipase，GCL)对具有C9位顺式双键的长链不饱和脂肪酸（如油酸、亚油酸和亚麻酸）具有高度底物特异性，可广泛应用于油脂改性、对映体药物拆分和生物柴油制备等领域。但其自然产量极低无法满足大规模应用的需要。因此，利用基因工程技术实现其异源高效表达，对该酶的工业化应用具有重要意义。本文构建了4种含有gcl基因的表达载体，同时构建了6种单启动子表达gcl基因的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)重组菌株、3种双启动子表达gcl基因的P.pastoris重组菌株和1种同时含有vgb基因和gcl基因的P. pastoris重组菌株。优化了含有gcl基因的P. pastoris重组菌株摇瓶发酵条件，将筛选得到的5种P. pastoris重组菌株进行了10-L发酵罐高密度发酵。主要研究内容和结果如下：1、以实验室保存的质粒DNA为模板扩增gcl基因，构建了诱导型表达载体pPIC9K-gcl、pPICZα-gcl、pFLDZα-gcl和组成型表达载体pGAPZα-gcl，分别电转至P. pastoris GS115或X-33中，得到6种基因工程菌，分别是GS115/9Kgcl、X-33/Zα-gcl、GS115/Zα-gcl、X-33/FLD-gcl、GS115/FLD-gcl和X-33/GAP gcl。采用BMMY-橄榄油罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选到1株酶活力最高的转化子GS115/9Kgcl78#，初始酶活力达220U/mL，并对此菌株进行单因子摇瓶发酵优化。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96h，每24h甲醇添加量1%，接种量2%，培养基初始pH7.0，摇瓶装液量50mL(500mL摇瓶)，甲醇诱导温度25℃时，酶活力可达735U/mL，是初始酶活力的3.34倍。2、以实验室保存的质粒DNA为模板扩增透明颤菌血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin，VHb)的基因vgb，构建载体pPICZX-vgb。以菌株GS115/9Kgcl78#为宿主，二次电转构建了3种双启动子重组菌和1种同时含有vgb基因和gcl基因的耐低氧重组菌。摇瓶发酵筛选得到3个双启动子高活力菌株GS115/9Kgcl-Zαgcl51#、GS115/9Kgcl-FLDgcl26#和GS115/9Kgcl-GAPgcl63#，它们的酶活力分别比GS115/9Kgcl78#提高40.8%，53.8%和27.5%。装液量100mL (500mL摇瓶)时，含有vgb基因的耐低氧重组菌株GS115/9Kgcl-ZXvgb43#，能够减弱低氧对GCL表达的抑制作用。3、运用基于TaqMan探针法的荧光定量PCR技术确定了重组菌GS115/9Kgcl68#、 GS115/9Kgcl78#、 GS115/9Kgcl86#、 GS115/9Kgcl-Zαgcl51#、GS115/9Kgcl-FLDgcl26#、GS115/9Kgcl-GAPgcl-63#的gcl基因拷贝数分别为2、3、1、5、4和4。确定了GS115/9Kgcl-ZXvgb43#中含有1个vgb基因拷贝。将重组菌约63kDa目的蛋白在MALDI-TOF-TOF中进行蛋白质质谱分析，通过软件Mascot搜索数据库鉴定出重组菌表达的目的蛋白是GCL。经Endo H糖苷内切酶酶切的GCL约为60kDa，与预测GCL大小一致，证实了GCL在P. pastoris异源表达过程中存在糖基化修饰。4、在10-L发酵罐高密度发酵中，以FM22基础盐培养基生长菌体，以甲醇进行诱导，单启动子重组菌GS115/9Kgcl78#的酶活力为6200U/mL。重组菌GS115/9Kgcl-Zagcl51#、 GS115/9Kgcl-Zαgcl26#、 GS115/9Kgcl-Zαgcl63#和GS115/9Kgcl-ZXvgb43#的酶活力分别比GS115/9Kgcl78#提高了45.2%、79.0%、35.5%和18.5%。其中，重组菌GS115/9Kgcl-Zαgcl26#的酶活力和酶活生产率较高，分别为11100U/mL和75.14U/(mL·h)，在这五种重组菌中均处于最高水平。本文利用双启动子策略和VHb共表达策略实现了GCL在P. pastoris中的高效表达，筛选到的重组菌在摇瓶和10-L发酵罐水平均获得很高的表达量，为GCL的工业化生产奠定了坚实的技术基础。