前言:　　 临床上大血管手术，通常需要阻断主动脉，引发脊髓缺血再灌注损伤[1]，导致损伤平面以下感觉和运动缺失，以及膀胱、肠道和性功能等不可逆的生理功能的障碍，给患者家庭和社会带来巨大的精神和经济负担，已成为现代医学中急需攻克的难题。　　 细胞移植治疗神经损伤是目前国际研究的热点之一，骨髓基质细胞(marrowstromal cells，MSCs)具有容易获得，体外增殖速度快，能够进行自体移植，还可进行基因修饰后移植等独特的优越性，用于脊髓保护具有良好的临床应用前景。迄今为止，关于MSCs移植治疗脊髓损伤的机制研究重点在MSCs分化、分泌神经营养因子、抗凋亡、促进髓鞘再生、促进局部新生血管生成和血管重建等方面。　　 血-脊髓屏障(blood-spinal cord barrier，BSCB)与血-脑屏障相似，位于毛细血管水平，是一个复杂的细胞系统，调节脊髓液体微环境在较小的范围内波动[2]，对维持中枢神经系统的内环境稳定起着非常重要的作用。脊髓损伤后BSCB完整性破坏，通透性增加，导致血液中的各种分子、蛋白进入脊髓实质，造成脊髓组织水肿、缺血缺氧、炎症以及脊髓血液灌注的改变，进一步加重脊髓损伤[3]。BSCB破坏与神经元和胶质细胞凋亡，神经炎症反应并列为脊髓损伤三大继发性病理改变。一些药物降低脊髓损伤后BSCB的破坏，同时提高神经功能的恢复，而另一些不能降低BSCB破坏的药物不能有效提高神经功能的恢复，这提示我们，保护BSCB的破坏是SCI修复的一个重要机制。MSCs移植对脊髓缺血再灌注损伤后BSCB完整性的影响尚未见报道。　　 因此，本研究首先研究MSCs移植对脊髓缺血再灌注损伤后BSCB的保护作用;其次进一步观察MSCs移植对脊髓缺血再灌注损伤后BSCB蛋白(Occludin、ZO-1、MMP-9和AQP-4）和抗血管通透性因子Ang-1及其受体Tie-2表达的影响，探讨MSCs移植保护脊髓缺血再灌注损伤后BSCB的作用机制。　　 材料与方法:　　 一、实验材料　　 （一）实验动物　　 日本大耳白兔，体重1.8-2.6 kg。　　 （二）主要试剂　　 伊文思蓝，甲酰胺，硝酸镧，二甲砷酸钠，戊二醛，mouse anti-occludin-FITCconjugate, mouse anti-ZO-1-FITC conjugate，mouse anti-CD31，鼠抗Occludin单克隆抗体，鼠抗ZO-1单克隆抗体，鼠抗MMP-9单克隆抗体，兔抗AQP-4多克隆抗体，羊抗Ang-1单克隆抗体，羊抗Tie-2单克隆抗体，鼠抗α-SMA单克隆抗体，鼠抗GFAP单克隆抗体，驴抗小鼠Alexa fluor594，驴抗山羊Alexa fluor488，S-P9000免疫组化染色试剂盒，BCA蛋白浓度测定试剂盒，ECL试剂盒，Real-timePCR试剂盒　　 （三）主要实验仪器　　 振荡水浴箱、电泳仪、离心机、干燥箱、酶标仪、Real-time PCR扩增仪、Leica SP2共聚焦显微镜、恒冷冰冻切片机、透射电镜　　 二、实验方法　　 1、阻断腹主动脉建立兔脊髓缺血/再灌注模型。　　 2、脊髓组织病理学检查，Tarlov评分评价脊髓缺血再灌注损伤对下肢运动神经功能的影响。　　 3、根据伊文思蓝经微血管外渗到脊髓实质评价BSCB完整性。　　 4、干湿法测定脊髓含水量，评价脊髓水肿。　　 5、电镜观察BSCB超微结构。　　 6、免疫荧光法测定损伤的脊髓组织中Occludin、ZO-1、Ang-1和Tie-2表达。　　 7、免疫组化法测定损伤的脊髓组织中MMP-9和AQP-4表达。　　 8、Westem-blot法测定损伤的脊髓组织中Occludin、ZO-1、MMP-9、AQP-4、Ang-1和Tie-2的蛋白表达。　　 9、Real time-PCR测定损伤的脊髓组织中Occludin、ZO-1和MMP-9的mRNA表达。　　 实验结果:　　 一、骨髓基质细胞移植对兔脊髓缺血再灌注损伤后血-脊髓屏障的保护作用　　 1、脊髓缺血再灌注损伤后神经功能评分降低，而且损伤后24h评分低于损伤后4h; MSCs移植可以改善神经功能评分。　　 2、病理学检查表明脊髓缺血再灌注损伤后脊髓灰质前角内健存运动神经元数量减少，而且损伤后24h少于损伤后4h; MSCs移植可以减轻脊髓病理损害。　　 3、伊文思蓝测定BSCB完整性表明脊髓缺血再灌注损伤后4h伊文思蓝经微血管外渗到脊髓实质，说明BSCB完整性破坏，损伤后24h外渗更多;MSCs移植可以显著减少伊文思蓝外渗。　　 4、脊髓缺血再灌注损伤后脊髓含水量增加，脊髓水肿，损伤后24h更明显;MSCs移植可以显著减轻脊髓水肿。　　 二、骨髓基质细胞移植对兔脊髓缺血再灌注损伤后血-脊髓屏障相关蛋白的影响　　 1、电镜结果发现脊髓缺血再灌注损伤后内皮细胞紧密连接开放，大量硝酸镧沉积于基底膜，并沿紧密连接外渗到血管外组织。MSCs移植组内皮细胞和紧密连接结构基本完好，基底膜紧贴于内皮细胞外侧，内皮细胞紧密连接开放，可见少量硝酸镧沉积于基底膜和外渗到血管外组织。　　 2、免疫荧光法表明缺血再灌注损伤后脊髓组织中Occludin和ZO-1沿微血管的表达由连续变为间断，阳性颗粒明显减少;MSCs移植组Occludin和ZO-1沿微血管表达较为连续，阳性颗粒增多。　　 3、免疫组化法表明缺血再灌注损伤后MMP-9表达增多，AQP-4表达减少;与损伤组相比，MSCs移植减少MMP-9表达，增加AQP-4表达。　　 4、Western-blot法表明缺血再灌注损伤后脊髓组织中Occludin、ZO-1、AQP-4蛋白表达减少，MMP-9蛋白表达增加;与损伤组相比，MSCs移植增加Occludin、ZO-1、AQP-4蛋白表达，减少MMP-9蛋白表达。　　 5、Real time-PCR法表明缺血再灌注损伤后脊髓组织中Occludin、ZO-1的mRNA表达减少，MMP-9的mRNA表达增加;与损伤组相比，MSCs移植增加Occludin、ZO-1的mRNA表达，减少MMP-9的mRNA表达。　　 三、骨髓基质细胞移植增加兔脊髓缺血再灌注损伤后Ang-1和Tie-2受体表达保护血-脊髓屏障　　 1、免疫荧光法表明缺血再灌注损伤后脊髓组织中星形胶质细胞和周细胞上的Ang-1表达增加，血管内皮细胞上的Tie-2表达增加;MSCs移植组Ang-1和Tie-2表达更多。　　 2、Western-blot法表明缺血再灌注损伤后脊髓组织中Ang-1和Tie-2表达增加，MSCs移植使Ang-1和Tie-2表达明显增加。　　 结论:　　 1、脊髓缺血再灌注损伤引起BSCB破坏， MSCs移植降低脊髓缺血再灌注损伤后BSCB通透性，并改善兔下肢神经运动功能和组织病理学变化。　　 2、MSCs通过减少脊髓缺血再灌注损伤后紧密连接蛋白Occludin和ZO-1缺失;增加AQP-4表达，下调MMP-9保护BSCB。　　 3、MSCs移植可以显著增加兔脊髓缺血再灌注损伤后Ang-1和Tie-2表达，修复BSCB破坏，发挥脊髓保护作用。