研究背景和目的干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。2000年,Gronthos等首次发现成人牙髓中存在具备自我更新和多向分化潜能的前体细胞并命名为人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)。牙髓干细胞的发现,为牙髓损伤修复机制的研究提供了一个新的平台,也为牙组织工程学带来了突破性进展。人牙髓干细胞可从患者拔除的第三磨牙或正畸牙中分离培养获得,由于来源于自体细胞,无免疫排斥反应,同时又具有多向分化潜能,可向成牙本质方向分化,使其成为牙组织再生研究的首选细胞。低氧是生命发育及生命体的基本现象,牙髓组织在正常生理状态下的氧体积分数显著低于常氧21%的氧体积分数。同时由于牙髓组织被高度不可让性的牙本质等硬组织包绕,当受到刺激时,血管通透性增加、组织压力上升,可导致低氧的进一步加剧。牙髓干细胞在牙髓组织的损伤修复过程中发挥着重要作用,目前对于其生物学特性的研究多数是在常氧环境下进行的,然而,无论是生理或病理状态,牙髓组织内的氧体积分数均显著低于常氧的氧体积分数,而且大量研究结果表明不同的氧体积分数可显著影响细胞的生物学功能。因此研究低氧环境下牙髓干细胞的生物学特性可为进一步阐明人牙髓干细胞在牙髓损伤修复中的作用及牙组织再生的研究提供重要理论参考。目前有关低氧环境下人牙髓干细胞生物学特性的研究较少,且现有研究结果存在较多差异。本实验旨在研究探讨低氧对人牙髓干细胞的增殖、迁移、成牙本质向分化及促血管生成特性的影响,为进一步阐明人牙髓干细胞在牙髓损伤修复及再生机制中的作用提供重要依据。本论文主要包括以下四章内容：第一章人牙髓干细胞的分离培养与鉴定本章实验利用组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞；流式细胞术检测细胞表面分子标记物；克隆形成实验检测细胞克隆形成能力；多向诱导实验检测细胞多向分化潜能。第二章低氧对人牙髓干细胞增殖、迁移的影响实验分别采用低氧(3%02)和常氧(21%02)培养人牙髓干细胞；流式细胞术检测低氧培养对人牙髓干细胞表面分子标记物、细胞周期分布及凋亡的影响；MTT法检测低氧对人牙髓干细胞增殖能力的影响；Transwell实验检测低氧对人牙髓干细胞迁移能力的影响。第三章低氧对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响qRT-PCR检测低氧组和常氧组人牙髓干细胞矿化诱导7 d、14 d、21 d后,成牙本质向分化相关基因ALP、DMP-1、DSPP mRNA的表达情况。第四章低氧对人牙髓干细胞表达成血管相关因子的影响qRT-PCR检测对比低氧组和常氧组人牙髓干细胞成血管相关因子VEGF、 SDF-1 mRNA的表达情况,并分别收集低氧组和常氧组人牙髓干细胞24 h、48 h、72 h的培养上清作ELISA检测,比较VEGF在蛋白水平分泌量的变化。材料与方法人牙髓干细胞的分离与培养取南方医科大学南方医院口腔颌面外科门诊18-25岁患者因正畸治疗或阻生需要拔除的完整、健康的第三磨牙和前磨牙(经患者知情同意),组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞。具体操作为：牙齿拔除后立即置于含双抗的DMEM培养液内送实验室(4h内),选用涡轮机牙钻在釉牙骨质界环绕牙颈部磨出一定深度的沟槽后(注意不能穿髓),在超净台内将牙齿沿沟槽劈开,无菌条件下取出牙髓组织(去除根尖孔端约2 mm的牙髓组织),置于含双抗的PBS缓冲液内反复漂洗至少3次,每次漂洗至少1 min。用眼科剪将牙髓组织剪碎为大小约mmx 1 mm的组织块,3 mg/mL Ⅰ型胶原酶37℃消化10-15 min后,加入完全培养基终止消化,800 rpm离心3 min,弃上清,加入少量培养液,轻轻吹打,使细胞悬液与松散组织呈混匀状态,然后移至25 mm2培养瓶内均匀铺开,翻转培养瓶加入3 mL培养液,24 h后翻瓶。每隔3d换液一次。待细胞生长至80%汇合行传代培养。克隆形成实验取第3代对数生长期的细胞,以100/孔的密度接种于6孔板,连续培养14d后,4%多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染色,倒置显微镜下观察克隆形成情况(以≥50个细胞为一个克隆)细胞表面分子标记物检测取第3代对数生长期的细胞,将其密度调至1×106/mL后,细胞重悬于预冷的PBS中。分别加入小鼠抗人PE标记的CD29、CD34、CD45、CD90及小鼠抗人FITC标记的CD44抗体,冰上避光敷育1 h。预冷的PBS清洗2次,上流式细胞仪检测。多向分化能力检测取第3代对数生长期的细胞,待细胞生长至80%汇合时,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,每2d换液一次,连续培养21 d,分别使用茜素红、油红O、阿利新蓝染色,倒置显微镜下观察。MTT实验取第3-5代对数生长期的细胞,以2×103/孔的密度接种于96孔板,到达时间监测点时每孔加入20 μL MTT,37℃避光孵育4h；吸去上清液,终止培养,每孔加入150 μL DMSO,充分振荡溶解结晶；多功能酶标仪上测定490 nm波长下各孔OD值。LIVE/DEAD法检测细胞活性取第3-5代对数生长期的人牙髓干细胞,分低氧组(3%02)和常氧组(21%O2)分别培养24 h、48 h、72 h后,去原培养液,加入PI/Calcein-AM混合荧光染色液,PI的终浓度为4 μmol/L, Calcein-AM的终浓度为2μmol/L,37℃孵育15-30 min后,去除染色液,PBS洗涤细胞1-2次,倒置显微镜下观察(死细胞可被PI染色,显微镜下观察为红色,活细胞可被Calcein-AM染色,显微镜下观察为黄绿色)细胞周期检测取第3-5代对数生长期的人牙髓干细胞,胰酶消化细胞,离心收集细胞,每样本细胞数不少于(3-5)x105。用0.2 mL预冷的PBS将细胞重悬为单细胞悬液,加入2 mL预冷的70%乙醇(无水乙醇和纯水按7：3配制而成,长期放于-20℃保存)固定细胞,混匀后,封口放置于4℃冰箱过夜。取固定过夜的单细胞悬液,1000 rpm离心5 min,弃上清,悬浮管底的细胞沉淀,在细胞悬液中加入2 mLPBS,混匀后1000 rpm离心5 min,弃上清,加入50μLRNaseA,再加入450μLPI染色液,4h内上流式细胞仪检测。细胞凋亡检测取第3-5代对数生长期的人牙髓干细胞,分低氧组和常氧组培养24 h后,胰酶消化细胞,每样本细胞数不少于(2-5)×105,1000 rpm离心5 min,弃去培养液,用2 mL预冷的PBS重悬细胞,1000 rpm离心5 min洗涤一次,弃上清,留沉淀。用试剂盒专用Binding buffer (含Ca2+)400μL重悬细胞,分成两管,每管200μL细胞悬液,一管为空白管不加任何试剂,另一管加入5μL的FITC标记Annexin V试剂,混匀,室温避光孵育15 min,然后加入10μL PI试剂,上流式细胞仪检测。Transwell实验取第3-5代对数生长期的人牙髓干细胞,无血清培养24 h,使细胞同步,胰酶消化,上室加入5×104个细胞,使用无血清培养基,下室加入含10%FBS的培养基,分低氧组和常氧组继续培养48 h,甲醇固定,0.1%结晶紫染色,倒置显微镜下观察计数。qRT-PCR采用Trizol法提取细胞总RNA,检测总RNA纯度和浓度。使用逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录为cDNA。采用SYBR Green法进行PCR扩增。以GADPH为内参基因,通过相对定量以2-△△Ct值代表基因的相对表达强度。ELISA取常氧及低氧分别培养24 h、48 h、72 h后人牙髓干细胞的培养上清,用ELISA试剂盒检测培养上清中VEGF的浓度(每个时间点设3复孔)。ELISA检测方法严格按照试剂盒说明书的操作步骤进行。统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,数据以x±s表示,两独立样本t检验进行两组间比较,检验水准α=0.05。结果1.成功分离培养人牙髓干细胞本实验采用组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞,所获细胞具有克隆形成能力；流式细胞术检测细胞表面分子标记物CD29、CD44、CD90(间充质干细胞分子标记物)阳性表达率分别为99.97%、100%、99.92%,CD34、CD45(造血干细胞分子标记物)阳性表达率分别为0.01%、0.47%；细胞具有多向分化潜能,可向成骨、成脂、成软骨方向分化。2.低氧对人牙髓干细胞表面分子标记物、增殖和迁移的影响本实验采用流式细胞术检测低氧组及常氧组人牙髓干细胞细胞表面分子标记物,结果显示低氧组和常氧组的人牙髓干细胞均高表达间充质干细胞表面分子标记物CD29、CD44、CD90,极低表达造血干细胞表面分子标记物CD34、CD45；流式细胞术检测低氧组和常氧组人牙髓干细胞的周期分布和凋亡,结果显示低氧组和常氧组的人牙髓干细胞周期分布及凋亡率均没有显著差异；采用MTT法检测对比低氧组和常氧组人牙髓干细胞的增殖能力,统计结果显示低氧组人牙髓干细胞增殖能力显著高于常氧组,Transwell实验结果显示低氧组人牙髓干细胞迁移能力显著高于常氧组。3.低氧对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响本实验采用qRT-PCR检测在矿化诱导不同时间后低氧组和常氧组人牙髓干细胞矿化相关基因的表达,检测结果显示矿化诱导7d后,低氧组人牙髓干细胞ALP、DSPP、DMP-1 mRNA表达量均低于常氧组,差异具有统计学意义。矿化诱导14d后,低氧组ALP、DSPP、DMP-1 mRNA表达量显著高于常氧组,差异均具有统计学意义。矿化诱导21 d后,低氧组ALP、DSPP、DMP-1 mRNA表达量仍均高于常氧组,其中ALP、DSPP mRNA表达差异具有统计学意义。4.低氧对人牙髓干细胞表达成血管相关因子的影响实验采用qRT-PCR和ELISA检测不同时间点(24 h、48 h、72 h)低氧组和常氧组人牙髓干细胞成血管相关因子在基因和蛋白水平的表达,检测结果显示低氧组VEGF mRNA表达显著升高,48 h表达升高最为显著,同时ELISA结果也显示低氧组VEGF蛋白分泌量显著高于常氧组；两组SDF-1 mRNA的表达均随时间延长而增加,但低氧组和常氧组SDF-1 mRNA的表达没有显著差异。结论1.实验采用组织块酶消化法成功从人牙髓组织中分离并培养出人牙髓干细胞,所获细胞具有间充质干细胞表型,细胞增殖能力强,具有克隆形成能力和成骨、成脂、成软骨向分化潜能。2.3%O2低氧培养人牙髓干细胞后,其仍具有间充质干细胞表型,细胞活性良好,细胞的增殖及迁移能力增强。3.矿化诱导早期,3%O2低氧可显著抑制人牙髓干细胞成牙本质相关基因的表达,但矿化诱导后期,则表现为促进人牙髓干细胞成牙本质相关基因的表达,提示3%O2低氧对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响存在时间上的差异。4.3%O2低氧可显著促进人牙髓干细胞表达VEGF,推测低氧可能对人牙髓干细胞促血管生成潜能具有促进作用。