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由缺血/低氧所引起的心脑血管疾病已经被认为是我国以及世界三大致死疾病之一,但目前临床上对其治疗及预防措施还不尽如人意。I/HPC是一种内源性保护机制,即亚致死性缺血/低氧预刺激可诱发组织器官对继发严重缺血/低氧所致损伤产生耐受。脑缺血/低氧预适应(I/HPC)引起的保护机制为临床寻找防治缺血/低氧性脑损伤的策略提供了新思路,但目前关于其发生发展的细胞分子机制尚不清楚。关于I/HPC细胞内信号分子机制研究已有大量报道,例如:腺苷和腺苷A1或A2受体、ATP-敏感K+通道、一氧化氮合成酶(NOS)等。然而,上述细胞信号分子机制并不能完全解释I/HPC的保护效应,且均涉及蛋白激酶C(protein kinases C,PKCs)激活。近年来关于PKCs在缺血/低氧预适应中作用已经有大量研究报道,本课题组研究发现cPKC7激活参与脑HPC形成;利用蛋白质组学技术我们鉴定出cPKC7与脑衰反应调节蛋白(CRMP2)能够发生相互作用,而且cPKCγ-CRMP2相互作用在HPC前后发生比较明显变化。研究表明在受到神经毒素和外伤损伤损后,神经元中CRMP2发生水解,并伴随有水解片段(BDP)生成;缺血低氧损伤后新生大鼠脑中CRMP2磷酸化水平显著降低,提示CRMP2及磷酸化在缺血/低氧中有重要作用。据此,本实验利用小鼠HPC和大脑中动脉阻塞(MCAO)所致脑局灶缺血模型,借助蛋白印迹、免疫共沉淀和免疫组化等生物化学技术,观察cPKCγ激活对小鼠缺血脑皮层内CRMP2蛋白水解程度(BDP)和磷酸化水平(p-CRMP2)、cPKCγ-CRMP2相互作用和小鼠脑皮层缺血半影区内p-CRMP2阳性细胞丢失影响,所获研究结果将进一步丰富人们对脑I/HPC信号转导机制的认识。
实验在室温20-22℃下进行,选用成年雄性BALB/c小鼠(12-14w,18-22g),动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIHPublicationNo.80-23)进行。实验动物随机分为假手术(S)、缺血(I)、预适应后缺血(HPC+I)、抑制剂(HPC+G06983+I)、溶剂对照(HPC+DMSO+I)等5组。应用小鼠整体HPC和脑中动脉阻塞(MCAO)脑局部缺血模型,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Westernblot)技术,分析CRMP2磷酸化和蛋白降解水平在脑HPC和缺血中的变化。结合免疫沉淀技术鉴定cPKCy活性对ePKCy-CRMP2相互作用影响;利用免疫组化技术进一步观察cPKCy对侧皮质组织内CRMP2磷酸化水平的影响。实验数据使用单一因素方差分析(OnewayANOVA)和进行统计学处理,并以均数±标准误(X±S.E)表示,其中p<0.05为差异显著。实验结果如下:
1.随着低氧暴露次数的增加,小鼠对低氧的耐受时间逐渐延长
与H1(低氧暴露1次)(15.9±0.6min,n=50)相比,H2(低氧暴露2次)(25.3±0.6min)、H3(低氧暴露3次)(31.6±0.6min)和H4(低氧暴露4次)(34.9±0.6min)小鼠的低氧耐受时间明显增加,且差异具有统计学意义(p<0.05,n=50pergroup)。提示本实验成功地制备了小鼠HPC模型。以下HPC小鼠特指低氧暴露4次组小鼠。
2.抑制cPKCγ激活取消HPC缓解脑缺血引起的cPKCγ-CRMP2相互作用减弱
本实验室前期借助蛋白质组学方法发现,HPC前后脑组织内cPKCγ-CRMP2相互作用发生明显改变。利用免疫荧光双标技术我们发现缺血小鼠脑皮层内cPKCy与CRMP2存在共定位,证明二者之间可能存在相互作用。借助免疫共沉淀的方法我们发现,正常情况下cPKCy与CRMP2之间存在相互作用,而缺血损伤可使两者相互作用减弱,但HPC预处理可使cPKCγ-CRMP2相互作用在一定程度上部分恢复;应用Go6983(5μl,6nM)后,HPC对缓解缺血所致cPKCy与CRMP2之间相互作用减弱的作用被部分消除,进一步证明cPKCγ与CRMP2之间存在相互作用。
3.cPKCγ参与HPC对缺血皮层半影区内CRMP2水解及磷酸化的调节
本实验发现,MCAO6h后,与假手术组相比,缺血组小鼠脑缺血皮层半影区内CRMP2被剪切,产生大量剪切片段(p<0.05,n=6pergroup),同时磷酸化水平显著下降(p<0.05,n=6pergroup);而HPC预处理后脑缺血皮层半影区CRMP2剪切片段明显减少(p<0.05,n=6pergroup),磷酸化水平增高(p<0.05,n=6pergroup);侧脑室注射cPKCγ抑制剂G06983(5μl,6nM)可明显抑制cPKCγ。有趣的是在应用Go6983(5μl,6nM)的同时,HPC对缺血半影区内CRMP2蛋白水解及其磷酸化水平的调节作用取消被抑制.与HPC+I组相比,抑制cPKCγ激活能够引起CRMP2蛋白水解程度增加,磷酸化水平降低(p<0.05,n=6pergroup)。而注射G06983(5μl,6nM)溶剂DMSO(0.01%)则对CRMP2蛋白水解及磷酸化没有明显影响。
4.抑制cPKCγ激活取消HPC缓解小鼠脑缺血皮层半影区内p-CRMP2下降作用
通过免疫组织化学的方法研究缺血半影区p-CRMP2阳性细胞在缺血后6小时后变化情况。结果显示在缺血后6小时,p-CRMP2阳性细胞明显减少(p<0.05,n=4pergroup),而HPC预处理能够明显缓解脑缺血所致p-CRMP2阳性细胞的丢失(p<0.05,n=4pergroup)。但是应用Go6983(5μl,6nM),则可取消HPC减轻脑缺血皮层半影区p-CRMP2阳性细胞的丢失作用。
本实验研究提示,cPKCγ参与低氧预适应对小鼠脑缺血皮层内CRMP2水解和磷酸化的调节,这种作用很可能是cPKCγ通过增加CRMP2磷酸化,减轻其水解来介导的。但是,cPKCγ是否可直接磷酸化CRMP2,cPKCγ-CRMP2信号通路在脑缺血/低氧性损伤和适应中的作用如何都有待进一步探讨。本研究所获成果丰富了人们对脑I/HPC信号转导机制的认识,而且为我们后续鉴定与HPC神经保护作用相关信号蛋白奠定了基础。同时,也为临床开发抗缺血/低氧性脑损伤药物提供了实验依据。