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目的从螺旋藻发酵物中分离纯化出螺旋藻激酶,通过质谱分析获得螺旋藻激酶的蛋白相关信息,为日后基因工程生产螺旋藻激酶和进一步研究其结构和功能提供理论依据。方法(1)制备螺旋藻激酶粗提液：螺旋藻发酵物通过水提法,再通过切向超滤系统超滤后获得螺旋藻激酶粗提液,选用考马斯亮蓝G-250染色法测定其蛋白含量；(2)螺旋藻激酶粗提液经SephadexG-75凝胶过滤层析进一步纯化,将获得的洗脱峰用纤维蛋白平板实验筛选出有溶栓活性的洗脱峰；(3)将有溶栓活性洗脱峰浓缩,进行SDS-PAGE电泳；(4)选用MADLI-TOF-TOF-MS质谱分析纯化的螺旋藻激酶的蛋白相关信息。结果1、螺旋藻激酶的分离纯化结果(1)螺旋藻发酵物通过水提法,再通过切向超滤系统超滤后获得螺旋藻激酶粗提液,考马斯亮蓝G-250染色法测定螺旋藻激酶粗提液的蛋白含量是1.735ug/ml。(2) Sephadex G-75凝胶过滤层析螺旋藻激酶粗提液经SephadexG-75凝胶过滤法分离,得到5个洗脱峰,以尿激酶为阳性对照组,纤维蛋白平板法检测各洗脱峰溶栓活性,其中只有第5个洗脱峰有明显的裂解圈,显示出溶栓活性,收集此峰洗脱液。(3) SDS-PAGE电泳结果Sephadex G-75凝胶过滤法分离得到5个洗脱峰,选用唯一有溶栓活性的第5个洗脱峰,SDS-PAGE电泳得到单一螺旋藻激酶蛋白条带,参照蛋白标准物,可知螺旋藻激酶的分子量约为45KD。2、螺旋藻激酶的蛋白相关信息：(1)编号为gi｜493675806的一级质谱报告,显示犬尿氨酸甲酰胺酶分子量为43705道尔顿,等电点为4.91,提示螺旋藻激酶的分子量接近43705道尔顿。质谱鉴定结果表明螺旋藻激酶固定的氨基酸修饰是C-端乙酰胺化,可变的氨基酸修饰是蛋白N端乙酰化、去酰胺化、二氧化物氧化。(2)编号为gi｜493675806的二级质谱报告,显示将待鉴定的纯化蛋白条带凝胶用胰蛋白酶酶切后,肽段混合物上MALDI-TOF-TOF,螺旋藻激酶纯化蛋白IYFPVYVEGAK肽段相对分子量是1284.6754,其观测值与理论值的偏差是百万分之121,该肽段相对于整个蛋白质的得分是76,氨基酸修饰位点是脲甲基化。(3)生物信息学分析结果表明螺旋藻激酶的氨基酸序列与蓝藻目极大节螺旋藻犬尿氨酸甲酰胺酶有较高相似度,蛋白覆盖率为35%,提示两者有同源性。结论从螺旋藻发酵物中成功纯化出电泳纯的单一条带的螺旋藻激酶,MADLI-TOF-TOF-MS质谱分析获得其蛋白相关信息,说明了螺旋藻激酶和犬尿氨酸甲酰胺酶有同源性,分子量接近43705道尔顿,分别约是纳豆激酶和豆豉纤溶酶分子量的1.5倍,螺旋藻激酶是一种有别于纳豆激酶和豆豉纤溶酶的新型纤溶酶。目的：通过体外培养野生型MEF细胞和突变型Zmpste24-/-MEF细胞,探讨螺旋藻激酶粗提液对野生型MEF细胞和突变型Zmpste24-/-MEF细胞的细胞形态、细胞活力及衰老细胞阳性率的影响,从抗衰老药物功效方面探讨螺旋藻激酶粗提液对野生型MEF细胞和突变型Zmpste24-/-MEF细胞的延缓细胞衰老作用,为开发新型抗衰老药物提供理论依据。方法：1、细胞株制备：从正常孕鼠怀孕13.5天后取小鼠胚胎成纤维细胞,传代培养,建立野生型MEF细胞模型；从Zmpste24+/-基因敲除杂合子孕鼠怀孕13.5天后取Zmpste24-/-基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞,传代培养,建立突变型Zmpste24-/-MEF细胞模型。2、实验分组：实验分组为空白对照组和给药组,空白对照组培养过程中用10%PBS+细胞生长液；给药组培养过程中用10%PBS+细胞生长液+10%螺旋藻激酶粗提液(0.036mg/ml),研究螺旋藻激酶粗提液对野生型MEF细胞和突变型Zmpste24-/-MEF细胞的抗衰老作用。3、检测项目：(1)将螺旋藻激酶粗提液作用于突变型Zmpste24-/-MEF细胞,显微镜下观察其细胞形态学的变化；(2)CCK-8法检测螺旋藻激酶粗提液影响野生型MEF细胞和突变型Zmpste24-/-MEF细胞的增殖情况并绘制细胞活力曲线；(3)p-半乳糖苷酶染色法检测螺旋藻激酶粗提液影响野生型MEF细胞复制性衰老细胞阳性率。结果：1、螺旋藻激酶粗提液影响突变型Zmpste24-/-MEF细胞的细胞形态学变化：空白对照组细胞排列不规则,体积较大形态扁平,胞内分泌型颗粒明显增多,胞质透明度低,部分核仁胀大破裂,核内颗粒释放。给药组生长良好,形态正常,呈长梭形或不规则形,细胞内分泌型颗粒极少,胞质透明度较大,核仁完整饱满、轮廓清晰,细胞呈河流状或放射状生长。2、螺旋藻激酶粗提液影响野生型MEF细胞和突变型Zmpste24-/-MEF细胞的增殖情况：从细胞活力曲线可见,正常孕鼠怀孕13.5天后取到的小鼠胚胎中培养的野生型MEF细胞,螺旋藻激酶粗提液作用后,CCK-8法测得其细胞活力在0-144h期间的96h和120h处理时间点分别为106.46%和129.03%(P(?)0.05),而120h处理时间点细胞活力最高；表明了在120h处理时间点的活细胞数目最多,细胞生长状态最好,对野生型MEF细胞影响最大。说明螺旋藻激酶粗提液对野生型MEF细胞起到延缓细胞衰老的作用。螺旋藻激酶粗提液对突变型Zmpets24-/-MEF细胞的细胞活力数据经过医学统计学方法分析,P(?)0.05,无统计学意义,说明螺旋藻激酶粗提液对突变型Zmpets24-/-MEF细胞无延缓野生型MEF细胞衰老作用。3、p-半乳糖苷酶染色法检测野生型MEF细胞衰老细胞阳性率：野生型MEF细胞空白对照组细胞染色阳性率为20.85%,给药组细胞染色阳性率为8.74%(P<0.05)。结论：1、螺旋藻粗提液可以维持突变型Zmpste24-/-MEF细胞的年轻态。2、螺旋藻激酶粗提液对野生型MEF细胞起到延缓细胞衰老的作用。3、螺旋藻激酶粗提液下调了p-半乳糖苷酶的表达活性,抑制细胞衰老,延长细胞寿命,促进了细胞的更新与增值。