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蛋白药物开发过程中的问题之一就是蛋白质分子的不稳定性,因此开发稳定性好、有效期长、适于企业生产的药物剂型尤为重要。目前临床上通常使用水针剂和冻干粉针剂两种剂型的蛋白质药物,水针剂生产和使用方便,不需要使用前复溶,但蛋白质稳定性不好,需要低温保存,冻干粉剂型蛋白稳定性好,运输存储方便,使用前需要复溶。真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein,Fip)是从灵芝、蘑菇等高等担子菌中提取的一类小分子蛋白质。其中重组灵芝免疫调节蛋白(recombinant Ganoderma Lucidum Immunoregulatory Protein,rLZ-8)是从灵芝中提取的一种真菌免疫调节蛋白,具有血细胞凝集、促进淋巴细胞的增殖及各种细胞因子的分泌、抗肿瘤、升高白细胞等生物学活性,近年来引起了科研人员的广泛关注,具有重要的研究意义。本课题组应用毕赤酵母菌株重组表达了rLZ-8,但发现rLZ-8在水溶剂中稳定性不佳,且液体状态使得存储和运输较为麻烦,不适合制备成水针剂使用,因此研究rLZ-8的冻干粉针剂至关重要。基于以上问题,本论文首先构建rLZ-8表达菌株,优化其发酵条件及纯化工艺,获得了符合要求的目的蛋白,随后对rLZ-8冻干粉针剂的处方筛选及冻干工艺进行了研究,主要包括以下三部分内容:一、rLZ-8表达菌株的构建、表达及鉴定基于毕赤酵母的密码子偏好性,重新设计编码了rLZ-8的基因序列,构建重组质粒p GAPZαA-rLZ-8,线性化重组质粒并电转化整合至X33酵母菌株的基因组中,对酵母阳性转化子进行鉴定之后摇瓶小量表达rLZ-8,检测不同转化子蛋白的表达,筛选出表达量最高的rLZ-8菌株。二、rLZ-8发酵工艺的建立及优化使用鉴定后蛋白表达量最高的菌株,在中试规模上进行rLZ-8的最佳发酵工艺条件摸索与纯化工作。将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后,接种到7.5 L的发酵罐中培养,通过调节发酵液的溶氧值(Dissolved Oxygen,DO)及生物量动态监测酵母菌的生长状态,ELISA检测发酵液中rLZ-8表达量。确定7.5 L发酵规模工艺参数:培养温度为28℃,培养时间为60 h,p H值为6.0,空气流量为2 v/v/m,溶氧控制为25%,搅拌转速控制为800 rpm。连续进行3批次7.5 L规模发酵稳定性实验,结果表明采用优化后的发酵条件获得的rLZ-8占全菌分泌产物的11.75%,蛋白产量达到528.09 mg/L。发酵获得的rLZ-8经分离纯化后纯度达到99.98%。三、rLZ-8冻干粉针剂的处方筛选及冻干工艺研究根据rLZ-8的理化性质及前期调研,选择磷酸盐缓冲体系(p H7.0)作为rLZ-8原液基本缓冲体系,辅料选择海藻糖、甘露醇、乳糖作为稳定剂,吐温-80、泊洛沙姆-188作为表面活性剂,进行rLZ-8辅料影响因素实验。结果显示,在高温条件下,各个辅料对rLZ-8含量、纯度、活性几乎无影响,均可用于后续研究。实验设计了9个处方组合进行活性、不溶性微粒、纯度的放样考察,筛选出rLZ-8适用的冻干粉处方:海藻糖50 mg、甘露醇50 mg、rLZ-8 10 mg。处方确定后,选取不同的温度、真空度、冻干时间,以性状和水分为考察指标分别进行单因素实验,对rLZ-8冻干工艺进行摸索。确定其适用冻干工艺:升华干燥条件为温度-29℃,真空度250 m Torr,干燥时间90 h,解析干燥条件为温度40℃,真空度250 m Torr,干燥时间30 h。