真菌多糖主要存在于真菌子实体、菌丝体和发酵液中,研究表明真菌多糖具有抗肿瘤、免疫增强、抗病毒等多种生物活性,尤其在抗肿瘤方面,真菌多糖可通过直接或间接途径来抑制肿瘤细胞增殖并诱导其发生凋亡,引起广大学者的关注。结肠癌是世界排名第三的消化道恶性肿瘤,随着人们生活方式和饮食习惯的改变,中国结肠癌的发病率和死亡率逐年上升。目前,治疗结肠癌的主要方式是手术切除、辅以化疗为主,但患者通常预后不良,出现严重的毒副作用。因此,寻找治疗或辅助治疗结肠癌的新型、无毒副作用的药物是必要的。拟康氏木霉(Trichoderma kanganensis)是本实验室从玉米秸秆中分离到的一株菌株,经鉴定,属于真菌类半知菌亚门、丝胞纲、木霉属,前期研究发现拟康氏木霉具有抑菌作用,但是并未对该菌的其它活性进行深入研究。黑根霉(Rhizopus nigricans)是一种接合菌丝状真菌,本课题组前期从其发酵液中提取分离到一种分子量为9,682 Da的活性多糖EPS1-1,证实EPS1-1具有免疫增强活性,可诱导人结肠癌细胞HCT-116和小鼠结肠癌细胞CT26凋亡,抑制S180荷瘤和CT26移植瘤小鼠肿瘤的生长和转移以及抑制氧化偶氮甲烷/硫酸葡聚糖(AOM/DSS)诱导的小鼠结肠癌的发生和发展,且提高结肠癌小鼠肠道的免疫功能。然而对EPS1-1的抗结肠癌分子机制并没有深入研究。本文将以两种真菌多糖为研究对象,旨在寻找对结肠癌有更高疗效的真菌多糖以及阐明其抑制结肠癌发生和发展的分子机制。1拟康氏木霉菌丝体多糖的制备、结构解析和活性研究拟康氏木霉发酵菌丝体经超声萃取、热水浸提、酒精醇沉、D301R阴离子大孔树脂脱色、Sevag试剂脱蛋白得到粗多糖,经DEAE Sepharose Fast Flow、Sephadex G-100、Sephacryl S-300凝胶柱层析进一步纯化得到均一多糖TPS,理化性质显示TPS的含糖量为99.529%,不含淀粉、蛋白质、核酸等物质。高效尺寸排阻色谱联用多角度激光散射分析显示TPS是单一组分,重均分子量为3.074×10s Da;高效液相色谱分析表明TPS由甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcA)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)组成,所占比例为45.5%、5.5%、10%和39%;红外光谱结果显示TPS具有多糖的特征吸收峰;甲基化和核磁共振分析结果表明TPS是以α和β两种糖苷键为主的吡喃型糖,其主链的连接方式为→6-α-D-Galp-1→5-β-D-Manf-1→5、6-β-D-Manf-1→5、6-β3-D-Manf-1→,支链 α-D-Glcp-1→4-α-D-Glcp-1→、β-D-Galf-1→和 α-D-Glcp-1→通过→5,6-β-D-Manf-1→的O-6 连接到主链上。体外培养人正常肝细胞L02、人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7和小鼠结肠癌细胞CT26,MTT结果显示,不同浓度的TPS处理细胞24h,TPS对L02无毒性,以浓度依赖的方式抑制A549、MCF-7和CT26细胞的增殖,对CT26细胞的抑制最显著,800 μg/mL时,抑制率为34.61%;AO/EB和Hoechst33258荧光染色结果显示TPS以浓度依赖的方式诱导CT26细胞凋亡。与前期研究的黑根霉胞外多糖EPS1-1的抗肿瘤活性相比,TPS的活性较低,接下来对EPS1-1的抗结肠癌分子机制展开研究。2黑根霉胞外多糖EPS1-1诱导CT26细胞发生凋亡以及抑制分阶段AOM/DSS诱导的结肠癌的发生和发展的分子机制研究体外实验:EPS1-1以时间和剂量依赖的方式诱导CT26细胞内AMPK信号通路激活,当EPS1-1的浓度为0.6 mg/mL,处理时间为36 h时,AMPKα的磷酸化程度最为明显,比对照组上升了 1.74倍(P<0.05),接下来采用此浓度此时间。Ⅰ.EPS1-1 使成功转染 AMPKα siRNA 的 CT26 细胞内 AMPKα 和 p-AMPKα蛋白的表达明显上调,与单独EPS1-1处理组相比,MTT和台盼蓝染色结果显示AMPKα的敲减使CT26细胞的活力分别上升到70.8%和69.47%(P<0.05),ELISA和Caspase 9检测结果显示EPS1-1逆转了由AMPKα的敲减造成的CT26细胞凋亡率降低的现象,仍不及EPS1-1单独处理时的凋亡率高,表明AMPKα的敲减抑制了 EPS1-1对CT26细胞的毒性。Ⅱ.CT26细胞经AICAR处理后,p-AMPKα、p-LKB1和p-ACC蛋白的表达水平明显增强,EPS1-1的加入更增强了这一过程。与单独EPS1-1处理组相比,MTT和台盼蓝染色结果表明AICAR的处理使CT26细胞的活力分别下降到49.07%和42.72%(P<0.05);ELISA和Caspase 9检测结果显示AICAR和EPS1-1共同处理显著增强了 CT26细胞的凋亡,表明AMPK的过度激活可加强EPS1-1对CT26细胞的凋亡作用。Ⅲ.EPS1-1能够抑制NAC对CT26细胞内ROS的抑制作用。与EPS1-1处理组相比,NAC明显阻断了 EPS1-1对AMPK信号通路的激活;与EPS1-1处理组相比,MTT和ELISA结果显示,NAC的处理使CT26细胞的抑制率由40.41%下降到31.41%(P<0.05),且CT26细胞的凋亡率也下降了 0.74倍(P<0.05),这些结果表明ROS是EPS1-1诱导CT26细胞内AMPK激活的必要物质,进而调节细胞的增殖和凋亡。ⅣV.CT26细胞内LKB1的敲减明显抑制了 AMPK信号通路的激活,EPS1-1的加入,使p-LKB1和p-AMPKα蛋白的表达有所增加;与单独EPS1-1处理组相比,MTT和ELISA检测结果显示,LKB1的敲减使细胞抑制率上升到77.58%(P<0.05),细胞凋亡率下降了 6.36倍(P<0.05),表明LKB1是EPS1-1诱导AMPK激活的上游信号,进而调节CT26细胞的增殖和凋亡。V.接下来对EPS1-1诱导AMPK激活的下游信号进行研究。EPS1-1显著下调CT26细胞内 p-mTOR、p-p70s6k、p-4E-BP1 和 Bcl-2 蛋白的表达;AMPKα 的敲减和Compound C的处理使细胞内p70s6k和4E-BP1的磷酸化以及Bcl-2蛋白的表达显著增加,EPS1-1处理后,这种增加水平被抑制:在AICAR处理的细胞中加入EPS1-1,Bcl-2蛋白的表达水平呈急剧下降趋势;mTOR的敲减和Rapamycin处理的细胞中,p-p70s6k、p-4E-BP1和Bcl-2蛋白的表达被下调,CT26细胞活力分别下降到76.16%和85.22%,待加入EPS1-1后,细胞活力分别再次下降到38.61%和50.03%,均有显著性差异(P<0.05),细胞的凋亡率显著增加;与空白组相比,Bcl-2的敲减使CT26细胞的活力下降到76.79%,加入EPS1-1后,细胞活力显著下降到51.72%,且细胞凋亡率明显升高;EPS1-1诱导的CT26细胞内Raptor的磷酸化明显被AMPKα的敲减所抑制,而AICAR的处理逆转了这一现象,IP结果显示,AMPKα能够与p-Raptor蛋白形成复合物。这些结果表明EPS1-1诱导的AMPK通路的激活通过直接磷酸化Raptor参与mTOR的激活以及Bcl-2的表达,进而调控CT26细胞的增殖和凋亡。VⅥ.EPS1-1能够以时间依赖的方式上调CT26细胞内p-JNK、p-ASK1和p53蛋白的表达,当AMPKα被敲减后,p-JNK、p-ASK1和p53蛋白的表达水平明显受到抑制;AICAR处理后,JNK又发生了磷酸化;IP结果显示,EPS1-1能够使AMPKα和ASK1形成复合物,而AMPKα的敲减逆转了这一现象;与单独EPS1-1处理组相比,SP600125处理后,p53蛋白的表达被抑制,细胞抑制率上升至75.73%,细胞凋亡率下降了 0.77倍。这些结果表明EPS1-1激活的AMPK和ASK1相互作用从而促进JNK-p53途径的激活,进而调节CT26细胞的增殖和凋亡。VH.EPS1-1能够显著上调CT26细胞内ATF4、CHOP和GRP78的mRNA和蛋白的表达水平,表明EPS1-1能够诱导CT26细胞发生内质网应激反应。体内实验:AOM/DSS联合使用分阶段建立诱导性结肠癌小鼠模型,体内研究不同时期内EPS1-1抑制结肠癌发生和发展的分子机制。肿瘤平均个数、肿瘤平均大小、结肠长度统计结果显示,EPS1-1显著抑制不同时期内结肠癌小鼠结肠中肿瘤的生长,第10周最为显著;各组小鼠结肠、肝、胃组织的HE染色结果显示,EPS1-1能够减轻不同时期内由AOM/DSS造成的损坏,第10周最为显著。免疫组化结果显示,EPS1-1显著降低不同时期内结肠癌小鼠结肠组织中p-4E-BP1蛋白的阳性表达,第10周较为显著(P<0.05);EPS1-1使不同时期内结肠癌小鼠结肠组织中 p-AMPKα、p-ASK1、p-JNK、p53、GRP78、ATF4、CHOP蛋白的阳性表达上调,第10周最为明显,具有统计学意义(P<0.05);qPCR和Western blot分析结果表明EPS1-1上调了小鼠结肠癌组织内p53的mRNA和蛋白的表达水平。以上结果表明,EPS1-1能够通过AMPK、mTOR、J-NK-p53以及内质网应激途径来抑制AOM/DSS诱导的小鼠结肠癌的发生和发展,且疗效主要在第10周。3 EPS1-1对AOM/DSS分阶段诱导性结肠癌小鼠结肠组织内代谢谱的影响利用液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS/MS)对AOM/DSS分阶段诱导的结肠癌小鼠各组的结肠组织进行代谢组学分析。采用PCA、PLS-DA等模式识别方法对CK组、Model组和EPS1-1组代谢物质谱进行分类并寻找EPS1-1干预诱导性结肠癌相关的生物标志物,结果显示无论正离子还是负离子模式下第10周的CK组、Model组和EPS1-1组均有较为明显的分离趋势,第19周和第28周各组的分离趋势不太明显;差异代谢通路的变化数目显示,EPS1-1组相比于Model组,第10周、19周和28周代谢通路数目分别为124、23和9条;总得代谢物的变化数目显示,EPS1-1组相比于Model组,第10周、19周和28周代谢物质数目分别为176、23和37个,这些结果均表明EPS1-1对AOM/DSS诱导的结肠癌在代谢水平上的作用主要集中在第10周。接下来根据VIP≥ 1.0、P≤0.05的标准对第10周的生物标志物进行筛选和鉴定,第10周共鉴定到30个潜在的生物标志物,均呈现一个明显的趋势,当Model组相对于CK组表现出上调或下调时,则EPS1-1组相对于Model组就会呈现相应的下调或上调,向CK组靠拢,共涉及三羧酸循环、精氨酸生物合成、嘌呤代谢、嘧啶代谢、抗坏血酸和醛酸代谢等11个代谢通路。这些结果表明EPS1-1治疗AOM/DSS诱导的结肠癌是通过多种代谢途径发挥药效作用的,且主要在第10周发挥作用,综上所述,拟康氏木霉菌丝体多糖TPS能够抑制CT26细胞的增殖并诱导凋亡,但是不及EPS1-1的活性高;EPS1-1能够体内外通过AMPK/mTOR、JNK-p53、内质网应激的途径以及干预结肠组织内多种代谢物质和代谢通路来发挥抑制结肠癌的作用,为将EPS1-1开发为治疗或辅助治疗结肠癌的药物提供了科学依据。