草乌头种子休眠解除过程生理生化变化及转录组分析

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草乌头(Aconitum kusnezoffii L.)为毛茛科多年生草本。广泛分布于我国东北、华北地区。传统蒙医药中草乌头块根、叶、花及芽等部位分开入药。干燥块根为重要特色蒙药材,也是常用的中药材,药材名为草乌(Aconiti Kusnezoffii Radix.),药材供给主要依靠野生资源,造成野生资源的紧缺。草乌头种子具有形态生理双休眠,在生理生化和分子层面的研究尚不清楚。因此,为了更好的探寻草乌头种子休眠解除过程的内部生命活动,本文以草乌头种子为研究对象,通过对其休眠解除过程的胚率变化、生理生化变化和内源激素变化,同时利用分子生物学技术,从转录组水平系统论述草乌头种子的分子机制,并进一步揭示草乌头种子休眠解除过程的复杂调控网络。主要研究结果如下:(1)种子胚率呈现慢-快-慢的变化趋势,在0d时种子胚率为23.31%,第0d到第14d种子胚率没有显著变化。第14d开始,种子胚率开始迅速升高,第42d达到最大值90.91%。之后种子开始露白,第49d时胚根长度达到0.75cm,第54d时胚根达到2.25cm,子叶长出。(2)主要的贮藏物质淀粉和脂肪含量呈现一直下降的趋势,较阶段Ⅰ分别下降了59.70%和45.63%;可溶性糖作为种子直接利用的营养物质,呈现先升高后下降的趋势,在阶段Ⅲ达到最大值24.12mg·g-1,较阶段Ⅰ上升了47.16%,之后可溶性糖含量下降至13.18mg·g-1,下降了45.36%;蛋白质含量呈现一直下降的趋势,从7.12mg·g-1下降到4.05mg·g-1;α-淀粉酶、β-淀粉酶呈现先上升后下降的趋势,在阶段Ⅳ达到最大值500μg·g-1·min-1(FW)和749μg·g-1·min-1(FW);蛋白酶和酸性磷酸酶活性呈现一直升高的趋势,较阶段Ⅰ分别升高了36%和147.31%。(3)SOD活性呈现先下降后上升的趋势,从44.8 U·mg-1下降到33.8 U·mg-1,再上升到最大值50.93 U·mg-1;POD活性呈现一直上升的趋势,从10.58 U·mg-1·min-1上升到32.97 U·mg-1·min-1;CAT活性呈现先上升后下降的趋势从2.3 U·mg-1·min-1上升到8.27 U·mg-1·min-1,后下降至4.4 U·mg-1·min-1。(4)ABA含量呈下降的趋势,较阶段Ⅰ下降了46.48%;GA3、IAA、Me JA和BR含量整体上呈现上升的趋势,较阶段Ⅰ分别上升了34.77%、60.71%、97.53%和17.95%;ZR含量呈现先上升后下降的趋势,从3.14ng·g-1·FW上升至4.35ng·g-1·FW,后下降到2.80 ng·g-1·FW。(5)转录组结果中,共有45644个差异基因(DEGs),通过对淀粉和蔗糖合成代谢途径、脂质合成代谢途径和激素合成代谢信号转导途径的表达模式分析,发现淀粉合成的多个关键酶ISV、AMY、E3.2.1.2的DEGs上调表达;蔗糖合成代谢相关Inv、GPT和glg A的DEGs有较高的表达量;糖酵解过程中关键限速酶HK和pkf A的DEGs上调表达;脂质合成代谢途径中,分解TAG的关键酶GPAT和PAP的DEGs显著上调表达,脂肪酸(FFA)降解的关键酶ACSL和MFP2蛋白的DEGs显著上调表达,经过乙醛酸循环中的多个MDH、ace B和E4.1.3.1的DEGs上调表达,转化为糖;在各种激素的合成代谢信号转导途径中,包括ABA、GA3、IAA、CTK、ETH、BR、JA和SA这8种激素,其中ABA、IAA、CTK和JA涉及的DEGs较多,其他涉及的DEGs较少,这些DEGs共同调控草乌头种子休眠解除。(6)鉴于TFs在种子休眠解除过程中发挥着关键作用,在种子休眠及解除过程中,一共有1509个TFs的DEGs存在差异表达。数量前6的TFs基因家族为C2H2共151个占全部TFs差异基因的10%,b HLH共96个占比6%,ERF共93个占比6%、b ZIP共91个占比6%、C3H共81个占比5%和MYB-related共76个占比5%。
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