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我国蛋白质饲料资源供求矛盾突出。每年产生大量羽、毛和蹄角等角蛋白资源,这些角蛋白富含二硫键、氢键及疏水基团,结构稳定不易被动物消化利用。物理、化学方法处理角蛋白存在能耗高、氨基酸破坏严重和环境污染等缺陷。高效生物降解更符合未来发展需求,打开二硫键,破坏角蛋白疏水结构是生物水解角蛋白的关键,实现打开这些化学键关键酶的高效表达对角蛋白生物处理产业化至关重要。本研究拟通过对地衣芽孢杆菌CP-16诱变(物理和化学)育种筛选获得具有高降解角蛋白效率正突变菌,为高效水解角蛋白奠定基础。同时,从CP-16中扩增出二硫键还原酶基因(Trx)、角蛋白酶基因(Ker),构建获得2株枯草芽胞杆菌WB600降解羽毛关键酶重组菌(B.subtilis WB600/pSTOP 1622-pTrx、B.subtilis WB600/pSTOP 1622-pKer)。并分析不同信号肽对目的基因(Trx、Ker)分泌影响,随后对重组菌进行发酵条件优化,实现CP-16降解角蛋白关键酶量产,并应用于角蛋白生物酶解中。运用紫外、硫酸二乙酯对原始菌进行多轮物理和化学诱变,经初筛与复筛得到了羽毛降解关键酶高产正突变菌。经紫外诱变后,突变菌V-8二硫键还原酶酶活、角蛋白酶酶活增幅最大分别为0.15U/mL、15.4U/mL,较出发菌分别提高83.1%、83.3%。硫酸二乙酯诱变后,突变菌D-5二硫键还原酶酶活增幅最大为0.14U/mL,较出发菌提高了67.5%,而突变菌D-2角蛋白酶酶活增幅最大为13.9U/mL,较出发菌提高65.5%。构建了2种角蛋白水解酶的表达质粒(pSTOP 1622-Trx、pSTOP 1622-Ker),电转入WB600并成功表达。在此基础上,通过无缝克隆手段,构建了含不同信号肽的筛选载体,在WB600中实现表达。结果表明,角蛋白酶搭载自身信号肽时胞外分泌角蛋白酶酶活最高。而二硫键还原酶搭载不同信号肽时仍在胞内表达,且酶活有不同程度的降低。通过优化重组菌发酵培养配方,重组菌B.subtilis WB600/pSTOP 1622-pTrx在玉米粉(5.1g/L)、葡萄糖(5.9g/L)、糖蜜(11.9g/L)、甘油(3.0g/L),蛋白胨(20g/L),Nacl(10g/L),发酵液OD600=1时加0.5%木糖诱导发酵48h能明显促进产酶,较其初始培养条件提高80.00%,较正突变菌V-8提高440.00%,较CP-16提高912.50%。重组菌B.subtilis WB600/pSTOP 1622-pKer在玉米粉(5.1g/L)、葡萄糖(5.9g/L)、糖蜜(5.9g/L)、甘油(3.0g/L),蛋白胨(20g/L),Nacl(10g/L),发酵液OD600=1时加0.5%木糖诱导发酵48h能明显促进产酶,较其初始培养条件提高49.74%,较正突变菌V-8提高269.48%,较CP-16提高577.38%。综上结果可得,诱变育种及CP-16降解羽毛关键酶基因枯草芽孢杆菌异源表达均能显著提高CP-16降解羽毛关键酶酶活,且枯草芽孢杆菌异源表达作为CP-16降解羽毛关键酶高效表达手段效果优于诱变育种。