目的：阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一种常见的发病于老年期的中枢神经系统退行性疾病，其临床表现主要为进行性智能减退，大脑记忆和认知功能障碍。随着人口老龄化的加剧，全球发病人数日益增多。由于AD患者严重影响其生活质量并给社会和家庭带来沉重的负担，因此对于该病的防治显得尤为重要。AD典型的病理特征为老年斑（SP）、神经元纤维缠结（NFTs）和神经元缺失。SP的形成与β-淀粉样蛋白（Aβ）的过量产生和沉积有关。到目前为止，它们与神经细胞退行性变之间的关系尚不十分清楚。NFTs的主要成分是异常过度磷酸化的Tau蛋白，它聚积在发生退行性变的神经元胞体并与AD患者临床痴呆程度呈正相关[1]，且Tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于Aβ异常。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要存在于神经元，具有促进微管组装和维持微管稳定的功能。在AD患者脑中Tau蛋白被异常过度磷酸化，从而丧失了正常的生理功能，进而缠结形成NFTs。已知有多种蛋白磷酸酯酶，如PP-1、PP-2A和PP-2B都参与了Tau蛋白的AD样异常过度磷酸化。 壳寡糖又称寡聚氨基葡糖（chitooligosaccharide，COS）或甲壳低聚糖（chitosan oligosaccharide），是由甲壳素（又称几丁质，chitin）脱乙酰化的产物壳聚糖（chitosan）降解获得，由2～10个氨基葡糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖。COS是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基寡糖，具有水溶性好、安全无毒、易被动物体吸收等优点。研究表明COS具有很多的生物活性，如抗氧化、清除自由基、免疫调节、抑菌和调节造骨细胞生长等多种生理功能。有文献证实，COS有提高神经干细胞的分化率和分化突起长度的作用，并且壳寡糖及可溶性的壳聚糖衍生物为BACE1（μ位点APP切割酶）的抑制剂。COS是否对于AD中Tau蛋白的异常过度磷酸化具有抑制作用，目前尚无文献报道。本实验通过冈田酸（okadaicacid，OA）诱导原代培养的大鼠海马神经元Tau蛋白过度磷酸化的细胞模型，观察COS对OA致海马神经元Tau蛋白过度磷酸化的作用。 方法：选用出生24小时的SD大鼠，无菌分离并培养海马神经元，倒置显微镜进行形态学观察，培养至7天，经冷丙酮固定后，尼氏染色鉴定神经元。选用OA诱导Tau蛋白过度磷酸化。实验分为正常对照组（normal）、溶媒对照组（vehicle-control）、OA损伤组（OAmodel）和10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml不同浓度壳寡糖预处理组（COS）。正常对照组细胞正常换液，COS预处理组于培养第二天换全液时加入不同终浓度的壳寡糖，并且在换液时维持其终浓度不变。细胞培养至第七天时，OA损伤组和COS预处理组加入终浓度为10nmol/L的OA（溶于10%DMSO中，使DMSO的终浓度不超过0.01%），溶媒对照组加入相同浓度的DMSO，作用12h。采用MTT法鉴定海马神经元的细胞存活率，分光光度法检测上清液中乳酸脱氢酶（LDH）含量的变化，免疫细胞化学、Westernblot方法观察、检测海马神经元内磷酸化Tau蛋白的表达变化并进行定量分析，观察OA对海马神经元的毒性作用及COS的保护作用。 结果： 1、原代培养大鼠海马神经元的鉴定倒置显微镜进行形态学观察，尼氏染色鉴定神经元，细胞胞浆内蓝紫色颗粒及明显的空泡状核，为神经元所特有，占细胞总数90%以上。细胞的数量与状态可用于本研究。 2、壳寡糖对OA致海马神经元细胞损伤的保护作用倒置显微镜进行形态学观察，正常对照组与溶媒对照组海马神经元细胞生长良好，胞体饱满呈梭形，折光性强，突起连接较密；OA损伤组大部分细胞胞体变圆，折光性差，突起断裂不连续甚至消失，细胞数目减少；COS预处理组各组的细胞形态有所改善，部分细胞突起出现，尤以20μg/ml和40μg/mlCOS预处理组细胞形态改善明显。 MTT结果显示，OA损伤组细胞存活率较正常对照组和溶媒对照组明显下降，COS预处理组的细胞存活率较OA损伤组升高，且以20μg/ml和40μg/mlCOS预处理组较为显著，有统计学差异（n=5，P<0.01）。 检测细胞上清液中LDH含量，OA损伤组LDH含量较正常对照组和溶媒对照组明显增高，COS预处理组的LDH含量较OA损伤组下降，且以20μg/ml和40μg/mlCOS预处理组较为显著，有统计学差异（n=5，P<0.05）。 3、COS降低OA致海马神经元细胞过度磷酸化Tau蛋白的表达免疫细胞化学结果显示，OA损伤组海马神经元细胞的胞体和突起Tau-pSer396的表达较正常对照组和溶媒对照组显著增多，呈现深棕黄色染色，COS预处理各组的Tau-pSer396阳性表达较OA损伤组减少，其中以20μg/ml和40μg/mlCOS预处理组的作用较显著。 Westernblot实验进一步证实免疫细胞化学的结果，定量分析表明，OA损伤组Tau-pSer396的表达量比正常对照组和溶媒对照组增加，而COS预处理各组则比OA损伤组降低，且以20μg/ml和40μg/ml浓度组降低显著，具有统计学意义（p<0.01）。 结论： 冈田酸能够引起原代培养大鼠海马神经元细胞的损伤并诱导Tau蛋白发生过度磷酸化；壳寡糖能够保护冈田酸对海马神经元细胞的损伤，且减轻Tau蛋白的异常过度磷酸化。