酸性蛋白酶高产菌株的诱变育种及工艺优化

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酸性蛋白酶是一种能在低pH下水解蛋白质为多肽和氨基酸的一类酶,其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性,因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。我国也在1956年以来陆续选育了一批优良产酸菌株,并已工业化生产。但长期以来,酸性蛋白酶的应用不广,产量不高,严重妨碍了我国酸性蛋白酶的应用推广,因此本研究以选育更高产酸水平的优良菌株为目标,进行了以下几方面的研究,并得到以下结论:(1)论文以宇佐美曲霉537为研究对象,利用紫外线射线、60Co-γ射线和等离子体对出发菌株进行诱变筛选试验,并比较了三种诱变方式对菌株的致死率及正负突变率的影响,并分别得到三种诱变方式的最佳诱变剂量为40min、0.5KGy和60×2.6×1013ions/cm2。结果表明,在分别选择了三种诱变方式的最佳诱变剂量下,三种诱变方式均得到了较好的诱变效果,等离子体诱变效果最佳,60Co-γ射线诱变效果次之。为了能够得到产酸性蛋白酶更好产量的优良菌株,论文最后以60Co-γ射线和等离子体复合诱变的方式筛选出最佳菌株CI07,产酶活力为1.333×104U/mL,原始菌株M-537酶活力为4.15×103U/mL,CI07菌株酶活力较原始菌株酶活力提高了221.2%,对CI07突变菌株进行传代稳定性实验发现,其产酶活力稳定性良好。(2)在发酵实验中,寻找适合菌株生长代谢的营养源以及发酵方式是一条可行的途径,对于发酵培养基组分的优化实验是提高产量必不可少的一个环节,通过培养基优化实验往往会使产量达到大幅度的提高。为了得到酸性蛋白酶的更大产量,本论文以确定最佳培养基成分和比例为初衷,对培养基优化进行了单因素影响实验和响应面分析试验,最终确定对突变菌株产酸性蛋白酶影响较大的因素为碳源(玉米粉)、氮源(豆饼粉)和磷酸盐(KH2PO4),并确定这三种成分最适值豆饼粉浓度为51g/L,玉米粉浓度为10.0g/L,KH2PO4浓度为3.1g/L。(3)通过考察不同初始pH、温度、装液量等培养条件对产酸性蛋白酶的影响,利用单因素实验可知,变异菌株CI07的最佳发酵条件初始pH值为6.0、温度32℃、接种量为6%、装液量为50mL、发酵时间72h。经过L9(34)正交试验可知,对产酸性蛋白酶影响显著的四个因素显著性顺序为:pH>接种量>装液量>温度。且其最佳值为初始pH值6.0、温度32℃、接种量为6%、装液量为50mL。经三次发酵验证试验可知OD值稳定,产酶量稳定,其酶活力值为:1.477×104U/mL。
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