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胚胎发育是一个复杂的过程,受到遗传与环境的交互调控。叶酸作为一种水溶性维生素,参与一碳单位的循环代谢、DNA的合成与甲基化,因此在胚胎发育过程中发挥着重要作用。之前研究表明叶酸缺乏可抑制正常的胚胎发育,如引起神经管畸形,此外还可在个体成年后引起肿瘤发生。microRNAs(miRNAs)是一类长约17-24个核苷酸的内源性单链非编码RNA,通过与靶mRNA完全或不完全互补配对,导致靶 mRNA降解或抑制其翻译,参与基因转录后调控。目前 miRNAs已被证实参与调控细胞增殖、分化、凋亡、细胞周期进展等生理过程。然而,叶酸缺乏如何影响胚胎发育过程及其具体调控机制仍不明确,miRNAs是否参与调控此过程仍需证实。 目的 1.以小鼠胚胎干细胞为模型,以细胞增殖和凋亡为切入点,探究叶酸缺乏对胚胎发育的影响以及潜在的调控机制;特别是miRNAs的调控功能; 2.为研究早期胚胎发育中的调控机制提供科学依据。 方法 1.小鼠胚胎干细胞分别置于完全培养基和无叶酸培养基中(正常叶酸组与叶酸缺乏组)培养96h;采用 CCK-8法检测叶酸对小鼠胚胎干细胞增殖活性的影响;流式细胞学方法检测细胞早期凋亡率及周期分布变化;实时荧光定量PCR法和免疫印记法检测Caspase-3表达变化情况; 2.采用基因芯片技术检测两组细胞miRNAs及mRNAs差异表达谱;选取与小鼠胚胎干细胞增殖和凋亡及细胞周期相关的特异性 miRNAs,采用茎环实时荧光定量PCR方法验证显著差异表达的miRNAs; 3.采用TargetScan6.0(mouse)软件预测特异性miRNAs的靶基因,其与mRNAs表达谱芯片结果取负相关,获取一组表达差异的mRNAs;构建 miRNA-mRNA网络图;交集基因显著靶向性功能分析(Gene Ontology,GO),构建miRNA-GO网络图,最终确定关键miRNA和mRNA; 4.采用TargetScan6.0( mouse)软件预测关键miRNA对其关键靶基因的潜在调控位点,同时双荧光素酶报告基因方法验证关键miRNA对其关键靶基因3UTR区的调控作用; 5.采用细胞转染方法,在叶酸缺乏组细胞中上调关键miRNA的表达,通过流式细胞学、实时荧光定量PCR法、免疫印记法研究关键miRNA对小鼠胚胎干细胞增殖、凋亡、细胞周期分布的影响。 结果 1.与正常叶酸组相比,小鼠胚胎干细胞叶酸缺乏培养72h后增殖能力明显下降( P<0.01),早期凋亡率明显增加(P<0.01),细胞周期在 G0/G1期阻滞, Caspase-3在mRNA和蛋白水平表达均显著上调; 2. miRNA表达谱芯片显示:与正常叶酸组相比,小鼠胚胎干细胞叶酸缺乏培养72h后,miRNA和 mRNA表达谱均存在显著差异,其中包括60个表达上调 miRNAs和34个表达下调 miRNAs,2316个表达上调的mRNAs和2544个表达下调的mRNAs;选取12个miRNA进行验证,检测结果与芯片结果一致,其中let-7a, miR-15a,miR-15b,miR-16,miR-29a,miR-29b,miR-34a,miR-130b,miR-125a-5p, miR-124表达显著上调,miR-290, miR-302a表达显著下调; 3.356个靶基因参与miRNA-mRNA网络图中,295个GOs参与miRNA-GO网络图;其中在表达上调显著性GOs中,富集度最高的为小G蛋白介导的信号通路,在表达下调显著性GOs中,富集度最高的为G1/S期转换过程;最终miR-302a与其靶基因Lats2分别被选定为关键miRNA和mRNA; 4. Lats2基因3UTR包含两个 miR-302a结合位点,双荧光素酶报告实验表明miR-302a能够靶向调控Lats2基因的3UTR;实时荧光定量PCR方法和免疫印迹法进一步证实miR-302a能够调控内源性Lats2基因的表达; 5.与转染对照组相比,转染miR-302a mimics后细胞克隆明显增大,早期凋亡率及晚期凋亡或坏死率明显下调,G1/S期阻滞明显缓解,由此表明miR-302a能够在一定程度上缓解叶酸缺乏引起的细胞周期特异性凋亡,促进胚胎干细胞的增殖。 结论 差异表达的特异性miRNAs可能参与调控叶酸缺乏导致的小鼠胚胎发育缺陷过程;miR-302a通过靶向调节Lats2基因,在叶酸缺乏引起的细胞周期特异性凋亡过程中发挥关键作用。