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木聚糖酶在造纸制浆、食品、纺织、饲料、能源工业中具有广阔的应用前景，但是，木聚糖酶要实现有效应用，要求木聚糖酶具有良好的酶学性质，在不同领域的应用要求木聚糖酶具有不同酶学性质。因此开发新的木聚糖酶，获得高产木聚糖酶基因工程菌具有重要的意义。本文采用不同的基因克隆方法分别从短小芽孢杆菌Bacillus pumilus、真菌Plectosphaerella cucumerina和Verticillium dahliae克隆到三个木聚糖酶基因，从土壤微生物DNA中克隆到10个木聚糖酶基因片段。将所克隆的木聚糖酶基因分别在毕赤酵母进行了高效表达，研究了重组酶的酶学性质，为木聚糖酶的有效应用奠定了基础。具体研究结果如下：1．短小芽孢杆菌（B．pumilus）木聚糖酶基因xynHB的克隆和在毕赤酵母的表达通过鸟枪法从短小芽孢杆菌B．pumilus中克隆到一个木聚糖酶基因xynHB，将该基因在毕赤酵母GS115中进行了表达，转化子25℃摇瓶培养在第4天达到最高值644U／mL，重组木聚糖酶的最适反应pH是6-9，最适反应温度是50℃。SDS-PAGE显示基因xynHB在毕赤酵母表达出了分子量分别为32.2kDa和29.6kDa的两条蛋白带，比推测氨基酸的分子量22.4kDa大，活性电泳显示这两条带均有木聚糖酶活性。经Endoglycosidase H去糖基化处理显示这两条带是同一基因表达产物的不同糖基化形式（30％和25％）。将该木聚糖酶的三个糖基化位点分别进行定点诱变，突变体在毕赤酵母进行表达，表达结果显示XynHB蛋白在GS115中表达时，在三个糖基化位点发生糖基化的几率为第一位点>第二位点>第三位点，第三位点发生糖基化的几率很低。同时，还可以看出如果在三个位点分别发生糖基化，就得到29.6kDa的带，如果在第一、第二位点或第一、第三位点同时糖基化，就得到32.2kDa的带，这暗示着基因xynHB在毕赤酵母表达糖基化程度的不同是由于在不同的糖基化位点糖基化的效率不同所致，而不是由于糖链的长短造成的。XynHB突变体的热稳定性实验显示第一糖基化位点的糖基化对提高重组酶的热稳定性有重要影响。2．食线虫真菌P．cucumerina木聚糖酶基因xynZG的克隆、表达及酶学性质研究利用BLAST搜索GenBank上的木聚糖酶，寻找保守氨基酸序列，设计简并引物，以食线虫真菌P．cucumerina的总DNA为模板进行PCR，扩增产物经测序判定为木聚糖酶基因片段。再通过基因组步行PCR的方法获得全长木聚糖酶基因序列。设计引物，通过RT-PCR扩增到该木聚糖酶的全长cDNA xynZG。序列比对显示该木聚糖酶基因全长780bp，含有两个50和46bp的内含子，推测的氨基酸序列和已知木聚糖酶的最高一致性为69％，这是从P．cucumerin克隆到的第一个功能基因。将684bp长的cDNA插入到毕赤酵母表达载体pHBM905B上，重组质粒导入毕赤酵母GS115，挑选在交联木聚糖平板上产生最大水解圈的转化子用于表达研究。25℃诱导3 d，重组木聚糖酶XYNZG表达量达最高362 U／mL。SDS-PAGE电泳检测表达蛋白的分子量为19 kDa。重组木聚糖酶经纯化后测得最适反应pH为6，最适反应温度为40℃。该酶在室温可以稳定10 h，4℃存放5个月仍有90％的酶活。以桦木木聚糖为底物，测得该酶的比酶活为363 U／mg，Km和Vmax分别为2.06 mg／mL和0.49 mmol／min／mg。5 mmol／L的EDTA不影响酶的活性，但是5 mmol／L的金属离子，大多数会抑制酶的活性，尤其是Hg+完全抑制了酶的活性。3．棉花黄萎病真菌V．dahliae木聚糖酶基因xynG的克隆、表达和酶学性质分析通过简并引物扩增真菌V．dahliae木聚糖酶基因片段，基因组步行PCR获得全长木聚糖酶基因序列。经BLAST比对分析，该基因含有一个大小为63 bp的内含子，利用DpnI介导的诱变方法对含内含子的全长木聚糖酶基因进行剪接，获得该基因的全长cDNA，推测的氨基酸序列和已知木聚糖酶的最高一致性为72％。将克隆到的cDNA在毕赤酵母GS115进行了表达，重组酶经纯化后测得该酶最适反应温度为45℃，最适反应pH值为6，在5-9维持50％以上的活性，对山毛榉材木聚糖具有最好的水解效果。Mg2+和Ca2+对酶有激活作用，分别提高了33.7％和16.6％，EDTA，β-巯基乙醇和NaN3对酶的活性基本没有影响，Tween-80和DMSO使酶活性提高了28.4％和12.8％。4．土壤微生物DNA木聚糖酶基因多样性的研究采用国产硅胶GF254代替进口Glass bead的改良方法抽提土壤微生物DNA，然后设计了一对扩增木聚糖酶基因片段的新简并引物，对抽提的土壤微生物DNA进行PCR扩增。扩增片段连接pMD18T载体木聚糖酶基因片段。对所得片段翻译的氨基酸序列进行BLAST分析表明有8个片段，转化大肠杆菌，重组片段通过酶切进行RFLP分析后，测序分析得到10个与来自放线菌的木聚糖酶具有较高的一致性，2个与假单胞菌的木聚糖酶具有较高的一致性。所得10个木聚糖酶片段的氨基酸序列同源性比较显示，第27个氨基酸均为天冬酰胺（N），暗示这些来自土壤微生物DNA的基因片段编码耐碱的木聚糖酶。通过构建系统进化树，发现扩增的木聚糖酶片段之间的一致性均在70％以上。