背景房颤是临床上最常见的持续性心律失常,普通人群的发病率约在1%-2%,其发病率随着年龄的增加而逐步增加,40-50岁时发病率小于0.5%,至80岁时则增加至5%-15%。房颤可导致脑血管意外致残,损害左心功能,降低生活质量,明显增加患者死亡率。有效的预防措施可以减少房颤相关的发病率和死亡率,但是抗心律失常药物往往疗效有限且具有致心律失常作用。为了开发出新的药物治疗靶点就需要对房颤发生的机制有新的认识。膜蛋白是一组重要的蛋白质,他们参与构成了细胞和细胞器边界的一部分。许多膜蛋白具有重要的功能,如参与物质转运、受体结合、信号传导等。由于目前大部分的心脏蛋白质组学研究主要是基于二维凝胶电泳技术,而二维凝胶电泳的主要缺点是不能与大部分的疏水性膜蛋白相兼容,这使得我们对膜蛋白的了解相对缺乏。同重元素标记的相对和绝对定量(iTRAQ)技术是2004年由美国应用生物系统公司(ABI)的Pappin及其同事开发的一种化学标记的蛋白质组学定量技术。4种或8种不同的样本经胰蛋白酶消化后通过iTRAQ试剂的自由赖氨酸基团标记在产生的肽段上,因为这些iTRAQ标记物是等重的,所以当结合到肽段时他们呢的质量没有不同。然而,当在串联质谱进行分裂时,每个标记物释放出一个带电的特征性报告离子,相互之间相差1Da。比较这4种或8种报告离子的峰值强度可得到样本中蛋白质的相对定量信息。该技术的最大优势是能够很容易的进行多通道实验。目的本研究项目拟采用iTRAQ定量蛋白质组学技术,辅助生物信息学的数据处理方法对正常窦律和慢性房颤患者的心耳组织中的蛋白质组进行定性和定量的解析,得到正常窦律和慢性房颤时左、右心耳组织之间的蛋白质差异表达谱。本研究特别关注与细胞骨架、能量代谢和细胞保护相关的差异表达蛋白质及其在慢性房颤发生和维持中的作用,寻找发生房颤的分子机制,探讨潜在的治疗靶标、制定个体化治疗策略、为复发患者的干预等提供理论依据。方法1.收集窦性心律和慢性房颤患者行二尖瓣置换术时的右心耳、左心耳组织标本,应用液氮研磨、裂解、超速离心获得心耳组织总蛋白。2.通过Bradford法测定总蛋白质浓度,行1DSDS-PAGE验证裂解液对心耳组织全蛋白质的提取效果并直观的观察所萃取的蛋白质的分布特点。3.取四组样品各]00μg蛋白质进行胰蛋白酶酶解,分别进行不同的iTRAQ试剂标记,混合后进行2维液相色谱串联质谱检测,重复分析鉴定两次。4.应用ProteinPilot3.0软件(ABI,USA)进行蛋白质数据库的搜索,设定相关参数后得到正常窦律和慢性房颤时左、右心耳组织之间的蛋白质差异表达谱。特别关注与细胞骨架、能量代谢和细胞保护相关的差异表达蛋白质及其在慢性房颤发生和维持中的作用。5.应用Western blotting法来检测窦性心律和慢性房颤时左右心耳之间桥粒斑蛋白、细胞色素c氧化酶亚单位5B和HSPβ1的表达变化,同时比较iTRAQ标记的串联质谱重复检测结果,以验证基于iTRAQ技术的定量蛋白质组学结果的可靠性。结果1.应用液氮研磨、裂解、超速离心等方法成功获得心耳组织总蛋白,经1D SDS-PAGE证实裂解液对心耳组织全蛋白质的提取效果良好。2.对窦性心律和慢性房颤时的左右心耳组织成功的进行了iTRAQ标记联合二维液相色谱串联质谱分析,总共得到792个非冗余蛋白质。对得到的部分差异表达蛋白质按细胞骨架、细胞能量代谢和细胞保护进行分类比较,不论在窦性心律或是慢性房颤时,左右心耳之间上述三类蛋白质的表达都存在一些差异。将慢性房颤时左右心耳与窦性心律时左右心耳相比时,上述三类蛋白质的表达差异更加明显。3.在窦性心律和慢性房颤患者中,左心耳组织中桥粒斑蛋白的含量较右心耳的高,并且慢性房颤时左右心耳组织的桥粒斑蛋白的含量均高于窦性心律时相对应心耳的含量。4.在窦性心律和慢性房颤时,左心耳组织中肌浆球蛋白调节性轻链2心房亚型的含量较右心耳的降低,并且慢性房颤时左右心耳组织的肌浆球蛋白调节性轻链2心房亚型的含量均低于窦性心律时相对应心耳的含量。相反地,房颤时左心耳组织内肌浆球蛋白调节性轻链2心室亚型较右心耳及窦性心律时左心耳的含量均增高。但是房颤时左心耳组织内心肌细胞收缩功能相关蛋白质原肌球蛋白出现下调。5.窦性心律和慢性房颤时左心耳与右心耳相比,有更多的能量代谢相关酶出现下调趋势,如电子传递黄素蛋白、细胞色素c氧化酶、ATP合酶、丙酮酸脱氢酶等。6.慢性房颤时左右心耳与窦性心律时相比,大部分的能量代谢相关酶也出现下调,如电子传递黄素蛋白、细胞色素c氧化酶、ATP合酶、果糖二磷酸醛缩酶和长链特异性酰基辅酶A脱氢酶等。除此之外,慢性房颤时左心耳比窦性心律时有更多的酶出现下调,如乌头酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰CoA连接酶和6磷酸葡萄糖异构酶等。7.窦性心律时左心耳中HSP70的表达较右心耳升高,在慢性房颤时,左心耳和右心耳分别较窦性心律时的左右心耳的HSP70表达升高,此外在慢性房颤时右心耳中的HSP70含量较左心耳的更高,与窦性心律时的情况相反。8.慢性房颤时左心耳内的HSP27表达水平较窦性心律时升高,而右心耳内HSP27的表达则较窦性心律时出现下调。9.应用Western blot法检测窦性心律和慢性房颤时左右心耳之间桥粒斑蛋白、细胞色素c氧化酶亚单位5B和HSPβ1的结果与iTRAQ标记的串联质谱检测结果基本一致,证实了基于iTRAQ技术的定量蛋白质组学结果的可靠性。结论1. iTRAQ标记的二维液相色谱串联质谱方法可用于心耳组织的定量蛋白质组学研究,并较准确的得到了窦性心律和慢性房颤时左右心耳组织的蛋白质差异表达谱。2.风湿性心脏病时慢性房颤可以造成心房组织尤其是左心房组织发生改变。这种改变主要表现为心房肌细胞之间的黏着连接加强,使得心房能够适应血流动力学改变所致的应力增加,但是这种适应性改变的过程中伴有心肌细胞收缩功能的下降。3.风湿性心脏病慢性房颤时左右心房肌细胞尤其是左心房心肌细胞的能量代谢系统受到明显的损伤。心肌细胞可能通过去分化、亚型改变等减少能量需求来适应能量不足的状态,达到相对的能量供需平衡,维持心肌细胞的生存,并且心肌细胞的重塑也将损伤其能量供应系统。4.HSP70可能参与保护由房颤引起的心肌损伤,而且左右心房在应激保护能力方面存在差异。