Caveolin-1是caveolae（细胞质膜微囊）的功能蛋白，它与细胞内外物质的转运、细胞的内吞以及细胞信号通路调节等功能相关。目前，caveolin-1和肿瘤之间的关系也逐渐成为一个新的研究热点。在许多肿瘤中发现caveolin-1的表达是下调的，而转染caveolin-1基因能明显的抑制某些肿瘤的恶性表型。因此，学多学者认为caveolin-1可能是一个抑癌基因。但在另一些肿瘤中，特别是前列腺癌，caveolin-1的表达却与恶性程度是正相关的：这使caveolin-1在肿瘤中的角色变得异常模糊，它到底是癌基因还是抑癌基因?Caveolin-1在不同组织类型中可能起着不同的作用。喉癌是耳鼻咽喉科常见的恶性肿瘤，在头颈部上皮来源的原发恶性肿瘤中排第2位；喉癌中绝大部分是鳞状细胞癌，且近年来其发病率在全世界范围内有上升趋势，严重威胁人类的健康，影响生活质量。目前针对喉癌的研究很多，但其确切的发病机制尚不甚清楚。Caveolin-1的表达在喉鳞癌的发生、发展中会发生什么样的变化；它和喉鳞癌病人的临床参数是否存在一定的相关性；转染caveolin-1基因会对喉鳞癌细胞造成什么样的影响?有文献报道，caveolin-1能影响细胞的凋亡，但其机制目前还不明了，其对喉鳞癌细胞的凋亡会有什么样的影响?这些问题目前在国内外尚未有文献报道。因此，本课题中我们制备了caveolin-1的真核表达质粒，稳定转染人喉鳞癌细胞株HEp2，通过体内和体外研究观察它对细胞生长和表型的影响；通过免疫组织化学研究喉鳞癌中caveolin-1表达的变化及其与临床参数的关系，为喉鳞癌发生机制研究提供实验依据，为临床喉鳞癌的诊断和治疗提供一定的理论基础。第一部分caveolin-1真核表达质粒的构建与稳定转染HEp2细胞目的构建caveolin-1真核表达质粒，筛选出稳定高表达caveolin-1的HEp2细胞。方法用PCR法从pc-3细胞的cDNA中扩增出人全长caveolin-1基因，并连接到真核表达载体pcDNA3.0上；用脂质体法把caveolin-1基因导入HEp2细胞中，通过G418筛选得到caveolin-1高表达的细胞克隆，并用细胞免疫荧光、实时荧光定量PCR和westernblot进行鉴定。结果制备得到caveolin-1真核表达质粒pcDNA3.0-CAV1，转染后经筛选得到3株稳定高表达caveolin-1的HEp2细胞克隆，分别命名为HEp2-CAV1-1、HEp2-CAV1-2和HEp2-CAV1-3，它们的caveolin-1 mRNA的表达水平分别为未转染组的6.89倍、108.73倍和75.03倍，caveolin-1蛋白表达水平分别为未转染组的3.49倍、11.56倍和7.56倍。小结成功构建了caveolin-1真核表达质粒，并筛选得到了稳定高表达caveolin-1的HEp2细胞株。第二部分转染caveolin-1基因对HEp2细胞生物学行为影响的体内外研究目的观察稳定转染caveolin-1基因对HEp2细胞生物学行为的影响。方法MTT法检测细胞的生长能力，软琼脂克隆形成实验检测细胞锚定非依赖性生长能力，流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡情况，免疫印迹法检测Bcl-2、p53和p21蛋白表达，裸鼠移植瘤模型检测细胞在体内成瘤能力及生长速度。结果MTT结果显示，高表达caveolin-1的细胞HEp2-CAV1-2和HEp2-CAV1-3生长速度明显慢于对照组；HEp2-CAV1-2和HEp2-CAV1-3细胞的锚定非依赖性生长能力被明显抑制，只形成7±3和8±3个克隆，与未转染组相比有统计学差异（t=9.79，P＜0.01；t=9.85，P＜0.01）；caveolin-1高表达能使更多的HEp2细胞停滞在G₁／G₀期，并且增加细胞的凋亡；转染caveolin-2基因能下调HEp2细胞内Bcl-2蛋白水平，但不影响p53和p21蛋白表达；细胞移植到裸鼠体内后，未转染组和转染空载组成瘤率均为100％（6／6），HEp2-CAV1-2组裸鼠均未长出实体肿瘤，HEp2-CAV1-3组成瘤率为66.6％（4／6），并且肿瘤生长速度明显减慢，形成的肿瘤重量明显低于对照组（P＜0.01）。小结caveolin-1高表达能够明显抑制HEp2细胞在体内、外的生长能力，能够使细胞停滞于G₁／G₀期，并且促进凋亡，其促凋亡的机制可能与Bcl-2表达的下调有关。第三部分转染caveolin-1基因对HEp2细胞EGFR及下游MAPKs通路的影响目的观察转染caveolin-1基因在HEp2细胞中对EGFR及其下游MAPKs信号通路的影响。方法免疫印记法检测HEp2-CAV1-2、HEp2-CAV1-3组、空载对照组和未转染组细胞的total-EGFR、p-EGFR、total-Erk1／2和p-Erk1／2蛋白水平；免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤中p-EGFR和p-Erk1／2蛋白水平。细胞免疫双标法和免疫共沉淀检测caveolin-1与EGFR的结合情况。结果HEp2-CAV1-2、HEp2-CAV1-3组细胞的EGFR相对磷酸化水平（p-EGFR／total-EGFR）分别只有未转染组的42.64％和38.20％，Erk1／2的相对磷酸化水平（p-Erk1／2／total-Erk1／2）分别为未转染组的13.08％和14.86％；免疫组化结果显示，HEp2-CAV1-3组移植瘤中p-EGFR和p-Erk1／2蛋白水平明显低于对照组；细胞免疫荧光双标和免疫共沉淀结果显示caveolin-1与EGFR在HEp2细胞中存在物理性的结合。小结在HEp2细胞中，存在caveolin-1和EQFR的结合，转染caveolin-1基因能抑制EQFR的磷酸化并下调其下游MAPKs通路的活性。第四部分人喉鳞癌组织中caveolin-1和hTERT的表达和临床参数的关系目的检测caveolin-1和人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA在人喉鳞癌组织中的表达变化，并分析其与各临床参数之间的关系。方法收集临床喉鳞癌新鲜手术切除组织标本，置液氮中保存；用原位杂交法检测人喉鳞癌组织中hTERT mRNA的表达，用免疫组织化学法检测组织中caveolin-1的表达；分别统计分析两者与临床参数的相关性，以及两者之间的相关性。结果喉正常组织、不典型增生、鳞癌组织中hTERT mRNA的阳性率分别为0％（0／10）、10％（1／10）、80％（32／40），喉鳞癌中hTERT mRNA的阳性率明显高于正常组织（P＜0.05）和不典型增生（P＜0.05）。喉鳞癌中hTERT mRNA表达水平与病理分级不相关（P＞0.05），与年龄、性别、TNM分期和淋巴结转移情况不相关（P＞0.05）。喉鳞癌中caveolin-1表达的阳性率为82.5％（33／40），低于喉正常组织100％（10／10）、不典型增生中的阳性率100％（10／10），但无统计学差异（P＞0.05）；其表达水平与病理分级不相关（P＞0.05），与年龄、性别、TNM分期和淋巴结转移情况不相关（P＞0.05）。hTERT mRNA表达水平与caveolin-1表达不相关（P＞0.05）。小结喉鳞癌中hTERT mRNA的阳性率明显高于正常组织和不典型增生，有助于喉部良恶性病变的鉴别；喉鳞癌中caveolin-1的阳性率低于正常组织和不典型增生，无统计学差异，但有待于进一步扩大样本量再分析。结论1、成功构建了caveoin-1真核表达质粒pcDNA3.0-CAV1，稳定转染HEp2细胞后筛选得到3株高表达caveolin-1的细胞克隆HEp2-CAV1-1、HEp2-CAV1-2和HEp2-CAV1-3。2、稳定转染caveolin-1基因能明显抑制HEp2细胞体内外生长和锚定非依赖性生长能力；使HEp2细胞停滞于G₁／G₀期，并促进凋亡；其促凋亡的机制可能与bcl-2的下调有关。3、在HEp2细胞中，caveolin-1能于EGFR结合，转染caveolin-1基因能抑制EGFR的磷酸化，并下调其下游MAPKs信号通路的活性水平。4、喉鳞癌中hTERT mRNA的阳性率明显高于正常组织和不典型增生，有助于喉部良恶性病变的鉴别；喉鳞癌中caveolin-1的阳性率低于正常组织和不典型增生，无统计学差异，但建议有待于扩大样本量进一步研究。