【摘 要】
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猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）可感染所有日龄猪只,诱发皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、多系统炎症等疾病,临床上感染率呈逐年上升的趋势。目前,尚无PCV3的商品化疫苗,临床上防控PCV3感染主要依赖于准确检测和生物安全措施。血清学检测方法具有方便快捷、操作简单、可检测出隐性感染等优势,并可监测动物抗体水平,是养殖场制定疫病监测和饲养管理方
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猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）可感染所有日龄猪只,诱发皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、多系统炎症等疾病,临床上感染率呈逐年上升的趋势。目前,尚无PCV3的商品化疫苗,临床上防控PCV3感染主要依赖于准确检测和生物安全措施。血清学检测方法具有方便快捷、操作简单、可检测出隐性感染等优势,并可监测动物抗体水平,是养殖场制定疫病监测和饲养管理方案的重要参考依据。免疫层析技术又因其快速高效、经济实用且无需太多专业背景知识等优点,拥有较为广阔的市场前景。因此,本研究拟建立一种快速、准确检测PCV3抗体水平的免疫层析方法。为此,本文开展以下工作:1.PCV3单克隆抗体的制备本研究以PCV3 ORF2 115～642位的核苷酸序列作为目的片段,对该目的片段进行大肠杆菌密码子优化并表达PCV3 Cap重组蛋白。经Western Blot鉴定,纯化的PCV3 Cap重组蛋白与PCV3阳性血清反应良好。以该重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用体外细胞融合技术和亚克隆筛选获得2株稳定分泌PCV3 Cap单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为4B1和4B3,抗体亚类分别为IgG3和IgG1。将4B1和4B3两株单克隆抗体作为一抗,在基于pCAGGS载体的真核表达系统开展间接免疫荧光试验,结果表明,4B1和4B3均能与真核细胞表达的PCV3 Cap蛋白产生特异性反应。2.PCV3抗体时间分辨免疫层析检测方法的建立本研究以竞争法为基础,将时间分辨荧光微球偶联的4B1单克隆抗体作为标记物,PCV3 Cap重组蛋白作为试纸条的检测线,羊抗鼠多克隆抗体作为试纸条的质控线,制备PCV3抗体时间分辨免疫层析试纸条。由实验分析可知,100μL微球最佳偶联100μg的4B1单克隆抗体,PCV3 Cap重组蛋白和羊抗鼠多克隆抗体最佳包被浓度分别为0.5μg/cm和0.3μg/cm,点样后第13 min为最佳检测时间。本方法曲线拟合方程为y=0.4402e-0.002X,R~2=0.9811,拟合度高,IgG抗体最低检测限为17.57mg/L,敏感性高,且与猪圆环病毒2型阳性血清、猪繁殖与呼吸障碍综合症阳性血清、猪伪狂犬病阳性血清、非洲猪瘟阳性血清等均无交叉反应,特异性强。该方法的批内和批间变异系数在1.22%～7.48%之间,均小于10%,重复性好。使用本方法与间接免疫荧光同时检测60份临床血清,检测结果符合率为88.33%,检测结果一致性较高。用本方法检测临床血清585份,结果显示,PCV3抗体阳性率为40.51%,说明PCV3在我国猪群中普遍存在。综上所述,本研究建立的PCV3抗体时间分辨免疫层析检测方法具有操作简便、检测快速、灵敏度高、特异性强、定量检测等优势,可用于PCV3抗体的血清学快速检测。
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