第一部分RANTES/CCL5天然突变体S24F基因重组腺病毒载体的构建与鉴定目的：构建携带天然RANTES/CCL5突变体S24F基因的重组腺病毒载体,制备能表达S24F蛋白的重组腺病毒,为体/内外干预移植排斥反应奠定研究基础。方法：根据Capoulade-Metay文献报告,按照序列信息通过化学合成法,设计合成目的基因S24F。BamH、EcoRI限制性内切酶对化学合成的目的基因S24F及穿梭载体pAV-MCMV-GFP-3FLAG进行酶切,用试剂盒对线性化的载体片段进行回收。目的基因片段与线性化的载体同源重组,将产物再转化DH5α感受态细胞。用菌落PCR鉴定阳性转化子,阳性克隆送公司测序。对测序对比准确的阳性克隆进行质粒抽提。采用AdMaxTM腺病毒包装系统,将携带S24F基因的腺病毒穿梭质粒pAV-MCMV-S24F-GFP-3FLAG与携带了腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒PBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,通过Cre/loxP重组酶系统的作用完成重组,产生重组腺病毒Adeno-S24F-GFP-3FLAG (Ad-S24F),利用氯化铯两步法超速离心法纯化及冻存,对照腺病毒Adeno-GFP (Ad-Null)不含目的基因与标签蛋白FLAG,仅含GFP。Titer-EZ腺病毒滴度检测试剂盒测定病毒滴度,免疫荧光及Western Blot检测S24F融合蛋白表达。结果：腺病毒穿梭质粒pAV-MCMV/S24F-GFP-3FLAG酶切鉴定正确,阳性克隆测序结果与S24F基因库中的序列完全相符,Titer-EZ腺病毒滴度检测试剂盒测定目的重组腺病毒Adeno-S24F-GFP-3FLAG滴度为7.10×1011PFU/mL,对照病毒Adeno-GFP (Ad-Null)为2.00×1011PFU/mL,免疫荧光及Western Blot鉴定Ad-S24F腺病毒表达载体成功携带目的基因并表达S24F融合蛋白。结论：成功构建携带天然RANTES/CCL5突变体S24F基因的重组腺病毒Ad-S24F及空质粒对照病毒Ad-Null,并在293T细胞中高效表达,为体／内外干预移植排斥反应奠定研究基础,并具有一定的应用价值。第二部分腺病毒介导S24F基因转染人脐静脉内皮细胞对RANTES趋化功能的影响目的：检测Ad-S24F转染人脐静脉内皮细胞后S24F蛋白的表达,探讨腺病毒介导S24F基因转染HUVECs对RANTES趋化作用的影响,为进一步研究S24F的功能提供实验基础。方法：参照Jaffe的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养方法并加以改进,分离培养HUVECs,体外经腺病毒Ad-S24F及Ad-Null分别转染48小时,利用荧光显微镜及Western Blot检测S24F融合蛋白在HUVECs表达并利用CCK-8试剂盒评估转染效率及最佳转染复数(MOI)。分离人外周血单个核细胞(PBMCs),并采用Tranwell小室法分析S24F融合蛋白对RANTES趋化功能的影响。结果：(1)Ad-S24F及Ad-Null成功转染人脐静脉内皮细胞,荧光显微镜及Western Blot分别能检测到重组蛋白表达,MOI20时为最佳转染复数,转染效率达到95%左右。MOI在80以下时,随着病毒数的提高转染效率相应微弱提高,转染后HUVECs存活率无明显差异P<0.05; MOI在80以上时转染效率相应提高,但转染后HUVECs存活率明显下降。(2)Ad-S24F转染HUVECs48小时后免疫荧光显示强烈红色荧光表达(S24F)及绿色GFP荧光蛋白表达,而对照病毒仅表达绿色荧光蛋白无S24F蛋白表达,空白对照组无任何荧光表达。(3)Ad-S24F转染HUVECs表达S24F能够抑制RANTES诱导的PBMCs穿内皮细胞的趋化作用。结论：Ad-S24F及Ad-Null能成功转染人脐静脉内皮细胞,并表达所含目的蛋白,腺病毒介导S24F基因转染人脐静脉内皮细胞能够抑制RANTES的趋化作用,为下一步在体实验提供理论依据及数据支持。第三部分腺病毒介导S24F基因转染延长同种异体小鼠心脏移植物生存时间及其机制探讨目的：应用小鼠同种异基因腹部异位心脏移植模型研究S24F对移植心脏的存活时间、炎性细胞的浸润情况、促炎相关因子表达的影响及其机制探讨。方法：以BALB/c小鼠为供体,C57BL/6J小鼠为受体,分别经供体主动脉根部顺行灌注腺病毒液Ad-S24F(1×109PFU), Ad-Null (1×109PFU)和无菌PBS液200μL4。C肝素盐水保存30分钟后,再建立小鼠腹部异位心脏移植模型,每天通过腹部触摸确定移植心脏跳动,以移植心脏停止跳动为观察时间终点,记录移植心脏存活时间。BALB/c及C57BL/6J小鼠各90只,分别随机分为三组：空白对照组；Ad-Null转染组；Ad-S24F转染组。Ad-S24F转染组为45对,空白对照组及Ad-Null转染组分别为20对和25对,分别于腺病毒转染移植心脏,移植术后3天、5天、7天、9天、11天和14天获取受体C57BL/6J小鼠血清及供心,每个时间点4只,利用Western Blot检测S24F蛋白表达在移植心脏及供体血清中的表达量及持续时间,HE切片观察炎症相关细胞在移植心脏的浸润情况。移植术后6天行免疫组织化学检测CD4+, CD8+, MOMA,和T细胞受体(TCR) αβ+细胞在移植心脏的表达,同时通过qRT-PCR和Western Blot检测RANTES、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、 TGF-β、CCR1、CCR3、CCR5、STAT1α、P-STAT1和IRF-1的mRNA和蛋白表达,以探索S24F在心脏移植排斥的角色及作用机制。结果：(1)Ad-S24F及Ad-Null转染后的移植心脏呈现强烈的绿色荧光蛋白GFP表达,Ad-S24F转染后的血清及移植心脏的Western Blot显示S24F在转染心脏后3-5天为表达高峰,2周左右下降至接近基线水平；Ad-Null转染后的血清及移植心脏仅可见GFP表达,未见S24F蛋白表达。(2)经供体主动脉根部顺行灌注腺病毒液Ad-S24F组移植心脏存活时间为13.00±0.33天,相比较Ad-Null组及PBS液组(9.38±0.60天,9.00±0.38天),P<0.05有显著统计学意义。(3)利用免疫组织化学平均光密度法(IOD)分析,转染Ad-S24F组与对照组比较,CD8+,MOMA,和TCR-αβ+细胞在移植心脏的表达明显减低,而CD4+淋巴细胞的表达并无明显不同。(4)利用qRT-PCR和Western Blot分析,转染Ad-S24F组与对照组比较,移植心脏中RANTES、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、CCR1、CCR3、CCR5、 STAT1α、P-STAT1和IRF-1的mRNA及蛋白表达下降,而TGF-β表达有微弱增加。结论：同种异基因心脏移植后出现急性排斥反应,移植物中RANTES、IFN-γ、 IL-1β、TNF-α等主要炎症细胞因子水平上调并激活RANTES/CCR和JAK/STATla信号通路；而诱导移植心脏过表达RANTES的天然突变体S24F首先可竞争性抑制RANTES与CCR1、CCR3、CCR5结合并使受体表达下调；其次抑制JAK/STAT1α信号通路激活,抑制STATla和IRF-1的激活及磷酸化而下调炎症细胞因子的表达水平,减轻炎症细胞在移植物中的浸润,从而延长移植存活时间,这说明S24F在移植排斥反应的病程中是通过竞争性结合并下调RANTES受体,抑制JAK/STAT1α信号通路而发挥负向调节作用。更为重要的是,这种天然存在于人体的变异体S24F可能是趋化因子网络的重要组成部分,参与并调控RANTES的生物活性。