L-色氨酸作为人体和动物生命活动中九种必需的氨基酸之一，参与生物体内多种物质的合成，在人和动物的生长发育以及新陈代谢过程中发挥重要作用，广泛应用于医药、食品和饲料等领域。目前，L-色氨酸主要通过微生物直接发酵方法进行生产，菌种多数由大肠杆菌（Escherichia coli）经历过诱变育种而选育;但是传统诱变育种筛选的菌株可能积累负效应突变、遗传背景不清楚和产酸机理不明确等问题，限制了对菌株的进一步升级改造。L-色氨酸的生物合成网络复杂，合成途径长、代谢流较弱、受到严格的反馈抑制和反馈阻遏调控以及合成过程中需要多种胞内代谢物的参与，导致菌株的产酸水平较低。因此，本论文针对上述问题，以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032为出发菌株，针对L-色氨酸的合成网络，分别对终端合成途径、磷酸戊糖途径和前体物PEP的供给等方面进行系统的代谢工程改造，分析了不同途径的改造策略对L-色氨酸产量的影响，构建遗传背景清楚的L-色氨酸的基因工程菌。同时，在谷氨酸棒杆菌中鉴定了一个新的丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，Pyk)同工酶，并在酶学性质、转录调控以及代谢功能方面进行了研究。　　针对谷氨酸棒杆菌L-色氨酸的终端合成途径，首先对关键酶邻氨基苯甲酸合成酶(Anthranilate synthase，AS)的trpE基因和邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(Anthranilate phosphoribosyltransferase，PRT)的trpD基因进行定点突变，解除L-色氨酸的反馈抑制作用，过表达解除反馈抑制的L-色氨酸操纵子基因trpEfbr GDfbr CBA，所构建的菌株CG262(WT/pWYE1317)摇瓶发酵72 h，L-色氨酸积累量为0.13±0.02 g/L。进一步敲除分支酸变位酶(Chorismate mutase，CM)的编码基因csm，阻断L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的分支代谢途径，所构建的菌株CG263（CG262△csm）摇瓶发酵72 h，L-色氨酸的积累量为0.31±0.01 g/L，比CG262提高了1.38倍，表明阻断分支代谢途径对L-色氨酸合成有促进作用。在此基础上，通过启动子替换的方式增加L-色氨酸操纵子的表达，增强L-色氨酸合成途径的代谢流。在谷氨酸棒杆菌中选取10个不同强度的启动子，通过检测β-半乳糖苷酶的活性和绿色荧光蛋白的荧光强度对启动子的强度进行了表征，为谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造提供了不同转录活性的调控元件。选择强启动子Ptac对L-色氨酸合成操纵子基因的启动子进行替换，解除其受到的反馈阻遏和弱化调节作用，改造的基因工程菌CG264（CG263-PtrpE∷Ptac）摇瓶发酵72 h，积累L-色氨酸0.61±0.06 g/L。这些结果表明阻断分支代谢途径结合解除L-色氨酸的反馈抑制和反馈阻遏的终端合成途径的改造实现了L-色氨酸的积累。　　针对L-色氨酸的前体物E4P的合成途径，在L-色氨酸终端合成途径改造菌株的基础上，采用两种策略增强磷酸戊糖途径的代谢通量。(1)替换果糖-1，6-二磷酸酶(Fructose-1，6-bisphosphatase，Fbp)编码基因fbp的启动子，使fbp基因的转录水平上调了4.85倍，所构建的菌株CG512(CG264-Pfb∷Ptuf)摇瓶发酵72 h的L-色氨酸积累量为0.66±0.03 g/L，比菌株CG264提高了8％。(2)对转酮酶操纵子（tkt-tal-zwf-opcA-pgl）的启动子进行替换，关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)的比活性提高了51％，菌株CG513（CG264-PtktA∷Ptac）的L-色氨酸积累量达到1.77±0.02 g/L，比菌株CG264提高1.92倍，而且丙酮酸节点的代谢副产积累量也明显降低。结果表明通过对转酮酶操纵子进行改造可以显著提高L-色氨酸的合成。　　为减少L-色氨酸的前体物PEP的消耗，采用阻断磷酸葡萄糖转运系统、增强PEP的生成以及阻断PEP生成丙酮酸等三种策略对PEP节点进行代谢工程改造。(1)敲除磷酸葡萄糖转移酶系统ptsG基因，使菌株的生物量比菌株CG112减少65％。(2)过表达PEP合酶(PEP synthase，Pps)的pps基因，菌株CG514（CG513-Ppps∷Ptac）的L-色氨酸积累量为2.23±0.04 g/L，比菌株CG513提高了26％。(3)敲除丙酮酸激酶编码基因NCgl2008，菌株CG515（CG513△NCgl2008）摇瓶发酵72 h的L-色氨酸积累量为2.44±0.06 g/L，比菌株CG513提高了38％。通过敲除NCgl2008基因减少PEP消耗的改造方式对于L-色氨酸积累的效果最佳。为进一步增强前体物E4P和PEP合成中间代谢物DAHP的能力，分别过表达来源于谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的五个不同的DAHP合酶，结果显示大肠杆菌aroGfbr基因过表达效果最好;将aroGfbr基因进行染色体整合，构建的菌株CG475(CG515-Ptac-aroGfbr)摇瓶发酵72 h积累L-色氨酸4.92±0.08 g/L。结果表明过表达DAHP合酶的改造策略可以明显促进L-色氨酸的积累。　　在对PEP节点改造进行分析时发现，除已鉴定功能的NCgl2008(Pyk1)以外，基因NCgl2809(pyk2)在谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组中注释为丙酮酸激酶，但其功能尚未证实。本论文系统研究了谷氨酸棒杆菌中新的丙酮酸激酶同工酶NCgl2809(Pyk2)的酶学性质、转录调控以及生理功能。首先，通过pyk1和pyk2基因缺失与回补突变株的D-核糖生长实验，证实Pyk2能够在胞内替代Pyk1行使丙酮酸激酶的功能。其次，序列同源性和二级结构比对分析的结果显示，Pyk2具有保守的丙酮酸激酶的催化位点和结构域，但Pyk2具有与典型的细菌丙酮酸激酶不同的二级结构。在酶活水平对Pyk2的性质进行分析，Pyk2的酶活依赖于二价阳离子和一价阳离子，酶动力学分析显示Pyk2以PEP为底物的S05和kcat值分别为4.58±0.74 mmol/L和5.58±0.53 s-1，以ADP为底物的S0.5和kcat值分别为0.33±0.03 mmol/L和4.36±0.22 s-1。结果表明Pyk2对底物的亲和力低于Pyk1。Pyk2活性受到果糖-1，6-二磷酸的激活、ATP和柠檬酸的抑制，而不受葡萄糖-6-磷酸的影响，说明Pyk2的酶活调节机制明显不同于Pyk1。以上研究结果显示同工酶Pyk2与Pyk1无论在二级结构、辅因子、底物亲和力和酶活调节机制等方面均具有明显差异，表明同工酶Pyk1和Pyk2在细胞内可能发挥不同的代谢功能。　　在不同的条件下，通过对菌株的生长、酶活性、胞内氨基酸和有机酸以及转录水平等方面的研究，分析了丙酮酸激酶同工酶Pyk1和Pyk2的基因缺失对谷氨酸棒杆菌生理代谢的影响。在好氧条件下以葡萄糖和丙酮酸分别为碳源，同工酶Pyk1比Pyk2明显影响菌株的生长和丙酮酸激酶的活性，而且pyk1基因缺失使胞内代谢物的浓度下降比率和回补途径基因的转录水平上调比率更加显著。结果表明同工酶Pyk1在好氧条件下发挥主要作用。RT-PCR实验结果显示在好氧条件下pyk2基因与乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，Ldh)编码基因ldhA共转录，其转录表达受到低氧浓度的诱导;而且在缺氧条件下，Pyk2的活性占丙酮酸激酶总活性的比率提高。通过测定缺氧条件下胞外有机酸浓度的变化，发现pyk1基因或pyk2基因的缺失都可以使乳酸的生成减少，而且过表达pyk1基因或pyk2基因能够显著增加丙酮酸激酶的活性，进一步提高乳酸的产量。在菌株WT中过表达pyk2基因使乳酸的积累量提高了17％，达到146.17±3.20 mmol/L。上述分析结果表明同工酶Pyk2主要在缺氧条件下发挥作用。为有效阻断PEP转化为丙酮酸，在敲除丙酮酸激酶pyk1基因的基础上，进一步敲除丙酮酸激酶pyk2基因，所构建的同工酶缺失的工程菌CG478（CG475△pyk2）摇瓶发酵72 h的L-色氨酸产量达到5.31±0.03 g/L，表明敲除pyk2基因有利于促进前体物PEP更多地导向L-色氨酸的合成。　　本论文以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，从头构建遗传背景清楚的L-色氨酸基因工程菌，首次同时敲除两个丙酮酸激酶同工酶基因，为L-色氨酸工程菌株的构建提供新的研究思路，为实现芳香族氨基酸及其衍生物的发酵生产提供理论基础。