【研究背景】子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有疾病，是母胎发病率和死亡率的主要原因。临床上，主要表现为母体高血压、蛋白尿、水肿、伴有或不伴有多器官系统损伤，如肾脏、肝脏、血液系统等；同时，伴有或不伴有胎儿综合征（包括胎儿宫内生长受限、胎儿宫内窘迫、羊水过少、围产儿发病率和死亡率增高等）。子痫是在子痫前期基础上发生的不能用其它原因解释的抽搐，其发生机制至今仍不明确。据报道，子痫在世界范围内发病率约为1.4%，在发达国家子痫导致的孕产妇死亡已很罕见，但在某些欠发达地区，子痫所致的孕产妇死亡率仍高达15%。终止妊娠通常是重度子痫前期/子痫的唯一有效治疗方法。尽管希波克拉底在公元前400年就对子痫进行了描述，但子痫的病因学研究进展缓慢。众多学者在上世纪九十年代尝试不同方法建立了子痫前期动物模型，而目前尚无子痫动物模型的相关报道，建立一个具备人类子痫基本特征的动物模型，将对这一疾病的病理生理学研究及探寻发病机制和有效的预防治疗方法具有重要的促进作用。第一部分戊四氮诱导类子痫抽搐动物模型的建立【目的】参照Faas等实验方法利用极低剂量内毒素对妊娠中期大鼠尾静脉注射的方法建立子痫前期动物模型，运用化学刺激（戊四氮腹腔注射诱导）的方法在子痫前期动物模型基础上建立一个能够模拟人类子痫发病特征的动物模型，对研究子痫发病机制、病理生理改变及探寻新的有效治疗手段具有重要的意义。【材料与方法】1、实验动物及分组：实验动物：SPF级8-10周龄的SD雌性大鼠（约200-240g）购于广东省实验动物中心，经过隔离检疫并适应性喂养一周后按雌雄大鼠2:1进行合笼，次晨行阴道涂片，镜检发现精子者标记为妊娠第0天；实验分组：39只大鼠随分为以下5组：1)正常非孕对照组NP (n=6)；2)正常妊娠对照组P（n=6）；3)子痫前期模型组PE（n=8）；4)类子痫模型组PE-PTZ (n=10)接受戊四氮腹腔注射诱发抽搐；5)硫酸镁治疗组PE-PTZ-Mg (n=9)接受戊四氮腹腔注射诱发抽搐前及硫酸镁治疗。2、子痫前期动物模型制作：参照Faas等人先前报道的实验方法利用极低剂量内毒素（l.0ug/kg体重，生理盐水溶解配制稀释为2m1）于大鼠妊娠第14天采用微量注射泵由尾静脉缓慢泵入，建立子痫前期大鼠模型；正常非孕及正常妊娠对照组给予等量生理盐水2ml尾静脉注射。3、类子痫动物模型制作：在子痫前期动物模型基础上大鼠妊娠第16、17、18天采用戊四氮（pentylenetetrazol, PTZ）腹腔注射的方法诱导抽搐发生，PTZ剂量通过查阅文献及预实验结果考虑致痫率及死亡率综合因素，采用40mg/kg体重。子痫模型组在大鼠妊娠第16、17、18天给予戊四氮40mg/kg体重腹腔注射诱发抽搐，观察大鼠抽搐生物学行为，观察各组抽搐情况；4、硫酸镁对抽搐的预防作用：根据先前文献经验，于妊娠第16、17、18天戊四氮注射前20分钟给予270mg/kg体重硫酸镁腹腔注射，观察各组抽搐情况；5、抽搐行为学记录：抽搐行为学分级参照Racine（1972）经典分级：1级：静止、凝视和咀嚼；2级：点头、湿狗样抖动及面部抽动；3级：一侧前肢震颤；4级：站立、双侧前肢震颤及持续性点头；5级：全身性强直—阵挛性发作。观察时间给药后30分钟。记录指标包括，（1）抽搐潜伏期：给药后到发生1级抽搐的时间；（2）五级抽搐潜伏期：给药后到发生5级抽搐的时间；（3）非五级抽搐持续时间：对30分钟内未发生强直—阵挛性抽搐的大鼠记录其由开始1级抽搐到恢复平静的时间；（4）五级抽搐时间：发生强直—阵挛性抽搐持续时间；（5）五级抽搐发生率：发生强直—阵挛性抽搐大鼠数量占组内实验大鼠总数的百分比。6、大鼠生理生化指标检测：妊娠第6、11、14、15、18天上午9:00-12:00间通过无创尾套法测量大鼠血压；妊娠第7、12、16、19天通过代谢笼收集大鼠24小时尿蛋白；非孕大鼠的相关生理指标监测时间点按同批次孕鼠的相应妊娠时间进行。妊娠第19天麻醉大鼠，取下腔静脉血离心收集血清后全自动生化分析仪检测谷草氨酸转氨酶（AST）、谷丙氨酸转氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）的水平。终止妊娠，剖宫取胎对仔鼠及胎盘进行计数称重，记录可见的吸收胚胎及畸形胎儿个数，对结果进行统计分析。7、统计学分析：采用SPSS13.0软件进行统计学分析，S-W方法进行正态性检验，正态分布计量资料用均数±标准误(x±s)表示，计数资料用百分数表示。各组间采用方差分析进行比较，方差齐性采用最小显著性差异检验（LSD），方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。重复测量的方差分析(analysis ofvariance for repeated measures)用于分析血压、尿蛋白指标；率的比较采用卡方检验或Fisher精确概率检验。 P<0.05表示差异有统计学意义。【结果】1、大鼠抽搐行为学：1)给予戊四氮腹腔注射后，各组大鼠均表现出不同程度的痫样抽搐发作行为，诱发抽搐时生物学行为符合Racine描述的抽搐分级：给予戊四氮腹腔注射后大鼠活动活跃，然后出现静止、凝视，随后开始表现为重复、刻板、持续性点头、咀嚼、湿狗样抖动，以及轻度惊厥，出现一侧前肢震颤、双前肢震颤、站立继而可能出现全身性强直一阵挛性发作；2)类子痫模型组抽搐潜伏期73.2±6.6s，五级抽搐潜伏期275.4±35.0s，五级抽搐时间41.0±3.5s，非五级抽搐时间587.0±175.4s，五级抽搐发生率7/10；3)硫酸镁治疗组诱发抽搐的时间（181.5±15.4s）较类子痫模型组（73.2±6.6s）明显延长（P <0.01），五级抽搐时间明显缩短（26.7±4.4vs.47.4±5.4s, P <0.05），且五级抽搐发生率在妊娠第17、18天显著降低（P <0.01）；2、大鼠生理生化指标水平变化：1)类子痫模型组血压与PE模型组无显著性差异（P <0.05），而较正常妊娠组和非孕组明显增高（P <0.01）；24小时尿蛋白变化与子痫前期组相同；血清ALT及AST在类子痫模型组明显增高（P <0.05），Cr和BUN浓度在各组间无明显差异；2)硫酸镁治疗组血压、尿蛋白变化趋势与类子痫模型组及PE模型组无显著性差异（P>0.05）；ALT、AST均较类子痫模型组降低，胎盘仔鼠重量较类子痫模型组增高，胚胎吸收率明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。【结论】1.成功在子痫前期模型基础上通过戊四氮腹腔注射的方法诱导子痫前期大鼠抽搐，建立类子痫模型；2.硫酸镁治疗后大鼠血压、尿蛋白未出现明显改变，但反映脏器功能指标明显降低，妊娠结局部分改善。第二部分类子痫抽搐动物模型中炎性反应的作用【目的】在戊四氮诱导子痫动物模型基础上，通过酶联免疫吸附法（ELISA）研究炎性因子在动物模型中的变化，探讨炎性反应与子痫抽搐发病的关系。【材料与方法】1、实验动物及分组：实验动物：SPF级8-10周龄的SD雌性大鼠（约200-240g）购于广东省实验动物中心，经过隔离检疫并适应性喂养一周后按雌雄大鼠2:1进行合笼，次晨行阴道涂片，镜检发现精子者标记为妊娠第0天；实验分组：57只大鼠随分为以下7组：6)正常非孕对照组NP (n=6)；7)非孕抽搐组NP-PTZ (n=8)接受戊四氮腹腔注射诱发抽搐；8)正常妊娠对照组P（n=6）；9)正常妊娠抽搐组P-PTZ (n=8)接受戊四氮腹腔注射诱发抽搐；10)子痫前期模型组PE（n=8）；11)类子痫模型组PE-PTZ (n=10)接受戊四氮腹腔注射诱发抽搐；12)硫酸镁治疗组PE-PTZ-Mg (n=9)接受戊四氮腹腔注射诱发抽搐前及硫酸镁治疗。2、动物模型制作：类子痫模型鼠制作处理如第一部分所述；正常妊娠抽搐组、子痫模型组在大鼠妊娠第16、17、18天，及非孕抽搐组在相应天数给予戊四氮40mg/kg体重腹腔注射诱发抽搐，观察大鼠抽搐生物学行为，观察各组抽搐情况；硫酸镁治疗组于妊娠第16、17、18天戊四氮注射前20分钟给予270mg/kg体重硫酸镁腹腔注射，观察各组抽搐情况；3、抽搐行为学记录：抽搐行为学分级参照Racine（1972）经典分级。记录指标包括，（1）抽搐潜伏期：给药后到发生1级抽搐的时间；（2）五级抽搐潜伏期：给药后到发生5级抽搐的时间；（3）非五级抽搐持续时间：对30分钟内未发生强直—阵挛性抽搐的大鼠记录其由开始1级抽搐到恢复平静的时间；（4）五级抽搐时间：发生强直—阵挛性抽搐持续时间；（5）五级抽搐发生率：发生强直—阵挛性抽搐大鼠数量占组内实验大鼠总数的百分比。4、大鼠血清炎性因子检测：妊娠第19天麻醉大鼠，取下腔静脉血离心收集血清后ELISA实验方法检测炎性因子TNF-α、IL-1β，血管生成因子sFlt-1、PlGF的血清表达水平，并进行统计分析。5、统计学分析：采用SPSS13.0软件进行统计学分析，S-W方法进行正态性检验，正态分布计量资料用均数±标准误(x±s)表示，计数资料用百分数表示。各组间采用方差分析进行比较，方差齐性采用最小显著性差异检验（LSD），方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。P<0.05表示差异有统计学意义。【结果】1、大鼠抽搐行为学：给予戊四氮腹腔注射后，各组大鼠均表现出不同程度的痫样抽搐发作行为，类子痫模型组抽搐潜伏期（73.2±6.6s）较正常妊娠抽搐组（107.0±7.4s）及正常非孕抽搐组(122.5±10.4s)明显缩短（P <0.01），而五级抽搐潜伏期，五级抽搐时间，非五级抽搐时间及五级抽搐发生率无显著性差异；硫酸镁治疗组诱发抽搐的时间（181.5±15.4s）较类子痫模型组（73.2±6.6s）明显延长（P <0.01），五级抽搐时间明显缩短（26.7±4.4vs.47.4±5.4s, P <0.05），且五级抽搐发生率在妊娠第17、18天显著降低（P <0.01）；2、大鼠血清炎性因子变化：TNF-α, IL-1β, sFlt-1及PlGF浓度在类子痫组达最高，而硫酸镁治疗后明显下降。硫酸镁治疗后TNF-α, sFlt-1及PlGF均明显降低，组间差异具有统计学意义。【结论】1.在类子痫动物模型中观察到子痫前期大鼠较正常妊娠及正常非孕大鼠抽搐阈值降低，硫酸镁治疗后，大鼠抽搐阈值增高；2.子痫前期模型鼠炎性因子水平较正常妊娠及正常非孕大鼠明显升高，硫酸镁治疗后大鼠炎性因子均明显降低。推测戊四氮诱发抽搐阈值的降低可能与炎症反应的严重程度有关。第三部分水通道蛋白（AQP4）在类子痫模型鼠海马组织中的表达【目的】水通道蛋白4（AQP4）是构成脑组织中水通道蛋白的主要成分，参与痫样抽搐发病，通过免疫组化、western blot方法、荧光定量PCR方法研究AQP4在类子痫模型鼠海马组织中的表达情况，探讨其在子痫发病中的作用。【材料与方法】1、实验动物及分组实验动物：具体条件如第一、二部分所述。实验分组：34只大鼠随机分为以下4组：1）正常非孕对照组NP (n=8)；2）正常妊娠对照组P（n=8）；3）子痫前期模型组PE（n=8）；4）类子痫模型组E(n=10)接受戊四氮腹腔注射诱发抽搐。2、子痫前期及类子痫动物模型建立：具体条件如第一、二部分所述。3、取材：妊娠第19日过量麻醉处死实验大鼠，采用断头法取得脑组织，冰上操作快速分离海马组织，一侧迅速放入液氮快速冷冻，随后转入-80℃冰箱保存备用；另一侧放入中性福尔马林固定用于制作蜡块。4、采用免疫组化对AQP4蛋白在海马组织中进行定位及半定量检测。荧光定量PCR法检测海马组织中AQP4的表达，采用相对定量方法比较经过处理的样品和未经处理的样品或内参样品目标转录本之间的表达差异。Western blot法检测海马组织中AQP4的表达，用Quantity One软件对蛋白免疫印迹条带进行分析，计算目的条带和内参条带灰度值的比值并进行比较。5、统计学分析：采用SPSS13.0软件进行统计学分析，S-W方法进行正态性检验，正态分布计量资料用均数±标准误(x±s)表示，计数资料用百分数表示。各组间采用方差分析进行比较，方差齐性采用最小显著性差异检验（LSD），方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。重复测量的方差分析(analysis ofvariance for repeated measures)用于分析血压、尿蛋白指标；率的比较采用卡方检验或Fisher精确概率检验。 P<0.05表示差异有统计学意义。【结果】1、大鼠海马组织AQP4免疫组化结果显示阳性染色呈棕褐或棕黄色，沿血管壁或者细胞膜分布。正常非孕鼠阳性染色颗粒较少见，正常妊娠组AQP4阳性染色相比非孕鼠增加，PE及类子痫模型鼠中表达明显增多。2、QPCR相对定量结果提示AQP4在PTZ诱发抽搐大鼠海马组织中的表达明显升高，其中类子痫模型组、子痫前期组明显高于正常妊娠组和非孕组（P <0.05），而正常妊娠组及非孕组间AQP4表达量无明显差异（P>0.05）。3、Western-blot灰度比值分析结果提示AQP4在正常妊娠和非孕组表达无明显差异，而在子痫前期及类子痫模型组明显升高（P <0.05）。【结论】AQP4在类子痫大鼠及PTZ诱发抽搐的大鼠海马组织中的表达明显增加，可能通过调节脑内液体平衡参与子痫抽搐的发生。