第一部分 联合应用卡托普利和氨沙坦对肺炎链球菌所致的鼓室硬化的作用机制的研究目的鼓室硬化(Tympanosclerosis)是长期慢性中耳炎愈合后所遗留的中耳结缔组织退行性病变,是导致传导性耳聋的重要原因之一。鼓室硬化的形成和发展可以对病人的正常交流造成影响,进而降低病人的生活、学习和工作质量,甚至还会影响病人的心理健康。但至今仍没有有效的药物来预防和治疗鼓室硬化症。近年来很多文献对机体器官硬化的机制研究表明,发生在各组织和器官的硬化症尽管在发生机制上有所差异,却也有很多相似的特征。卡托普利和氯沙坦是治疗多种器官硬化的常用药物,如动脉硬化和肾硬化,却从未应用于治疗鼓室硬化症。在我们的实验中,通过中耳注射肺炎链球菌建立鼓室硬化的动物模型,以此来研究卡托普利和氯沙坦联合应用对鼓室硬化有无治疗作用以及可能的相关机制。方法1.实验分3组。空白对照组不做处理。应用鼓膜穿刺术向右耳内注射3型肺炎链球菌分别建立了豚鼠和大鼠的鼓室硬化的模型。然后根据是否使用卡托普利和氯沙坦进而分为鼓室硬化组和用药组。饲养6周。2.每周通过耳镜观察各组鼓膜钙化的情况,以此从肉眼来判断鼓室硬化的发展过程。3.6周后,听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)分别检测豚鼠和大鼠各组的听力情况。ABR使用click声进行刺激,纪录结果。4.ABR检测完后,分别解剖出豚鼠和大鼠各组动物的中耳鼓室黏膜组织。制作HE切片染色判断中耳炎症发生情况。von Kossa染色来判断各组中耳鼓室黏膜钙化的情况。5.免疫组化和Western blot从蛋白水平上检测豚鼠和大鼠各组中耳鼓室黏膜TGF-β1表达含量的变化。6. RT-PCR从RNA水平上检测大鼠中耳鼓室黏膜中TGF-β1表达含量的变化。结果1.耳镜观察结果显示,联合应用卡托普利和氯沙坦在豚鼠和大鼠中都降低了鼓室硬化的发生率。正常对照组和未注射肺炎链球菌的左耳都未见异常。6周后豚鼠和大鼠鼓室硬化组鼓室硬化的发生率均为100%。用药组右耳有不同程度的减轻。6周后,用药组豚鼠组鼓室硬化的发生率降低为53%；用药组大鼠组降低为63%。2.听性脑干反应结果显示,用药组相对于鼓室硬化组联合应用卡托普利和氯沙坦能部分恢复听力功能。正常组听力,豚鼠为10.25±1.17 dB,大鼠为7.75±0.85 dB；鼓室硬化组听力,豚鼠为62.31±1.06 dB,大鼠为57±1.83dB；用药组,豚鼠为36。39±1.41 dB,大鼠为35.5±1.92 dB。3.HE结果显示,在第6周,豚鼠和大鼠鼓室硬化组的中耳鼓室黏膜均明显增厚,有炎症细胞和新生血管。在卡托普利和氯沙坦联合用药组,豚鼠和大鼠的中耳鼓室黏膜厚度、炎症细胞和新生血管较鼓室硬化组均明显降低。4. von Kossa染色结果显示,鼓室硬化组中耳鼓室黏膜可见明显的棕黄色深染的颗粒,说明有钙化形成。而正常对照组没有,用药组较轻。5.免疫组化和Western blot结果显示,豚鼠和大鼠的鼓室硬化组,中耳鼓室黏膜中TGF-β1的蛋白水平含量明显升高,而用药组有所降低。6. RT-PCR结果显示,大鼠的鼓室硬化组中耳鼓室黏膜中TGF-β1的RNA水平含量明显升高,而用药组有所降低。结论联合应用卡托普利和氯沙坦可以改善肺炎链球菌引起的鼓室硬化过程,而这一作用可能是与降低TGF-β1的过表达有关。第二部分 螺旋神经节细胞的新型培养模式的建立目的在听觉神经系统中,螺旋神经节细胞是位于耳蜗螺旋神经节内的初级听觉传入神经元,它将耳蜗柯蒂氏器毛细胞感知到的声音信息通过耳蜗神经传入到脑干听觉中枢。螺旋神经节细胞的损伤或继发于毛细胞损伤后的螺旋神经节细胞退化可以导致感音神经性聋。近年来关于神经因子对螺旋神经节细胞的存活和神经节细胞双极神经突的再生的研究越来越热。而这些体外实验的主要研究方法就是螺旋神经节细胞的原代体外培养。传统的体外培养模式不能将螺旋神经节细胞和胶质细胞分开,而且2D的培养环境有很多固有的局限性,不能很好的体现体内螺旋神经节细胞所在的内环境。虽然3D培养被广泛的用于了解组织的空间结构,但至今还没有关于单纯螺旋神经节细胞体外3D培养的报道。在我们的研究中,我们用Bhlhb5cre和ROSA 26-td Tomato的老鼠交配得到Bhlhb5和ROSA 26-td Tomato双阳性小鼠,并通过流式筛选得到纯化的螺旋神经节细胞,对其进行3D体外培养,并对其在神经细胞形状、轴突长度和功能上与2D培养进行分析和比较。方法1.用Bhlhb5cre和ROSA 26-td Tomato的老鼠交配,经基因型鉴定得到Bhlhb5和ROSA 26-td Tomato双阳性小鼠。2.选用P3-P5的乳鼠耳蜗解剖进行基底膜铺片和耳蜗切片,进行免疫荧光染色,验证Tomato阳性细胞是否是螺旋神经节细胞。3.选用P3-P5的乳鼠耳蜗解剖得到蜗轴的细胞悬液,进行流氏筛选,把Tomato阳性和阴性的细胞分别收集,以备后续使用。4.对筛选过的细胞进行RT-PCR和免疫荧光染色,来验证经过流氏筛选Tomato阳性的细胞是否是神经细胞。5.对流氏筛选过的Tomato阳性细胞分别进行2D和3D培养,并分别在培养后1 d、2d、3d、4d、5d、6d、7d,4%甲醛固定后进行免疫荧光,对不同天数的神经细胞在存活率、细胞形态、细胞轴突个数和长度进行比较。结果1.基底膜铺片和耳蜗切片免疫荧光结果显示,体内Tomato阳性的细胞和NF阳性的细胞共染。说明Tomato阳性的细胞是螺旋神经细胞。2.免疫荧光的结果显示,经流氏筛选出的Tomato阳性细胞是和Tuj-1或Neun抗体共染,说明筛选出的阳性细胞是神经细胞；而筛选出的Tomato阴性细胞是和Sox-2抗体共染,说明筛选出的阴性细胞是非神经细胞。3. RT-PCR的结果显示,经流氏筛选出的Tomato阳性细胞中Tuj-1的含量比Tomato阴性细胞中高出10倍多,而流氏筛选出的Tomato阴性细胞中Sox-2的含量比Tomato阳性细胞中高出300多倍。4.免疫荧光的结果显示,经3D培养后的螺旋神经细胞存活率比2D培养条件下要高。5.免疫荧光的结果显示,经3D培养后的螺旋神经细胞与2D培养条件下相比,双极神经元的细胞数比例升高,细胞的轴突长度明显增长,轴突分支也明显增多。结论在这个实验中,我们通过转基因老鼠和流氏筛选得到了纯化的螺旋神经节的细胞。3D培养条件下培养的螺旋神经节细胞与2D培养条件下相比,有更高的存活率,双极螺旋神经细胞的比例升高、细胞的轴突长度明显增长,轴突分支也明显增多。