阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease)属于神经退行性疾病,是当今社会严重危害人们健康的疾病。起病隐袭,发病机制复杂,其中兴奋性毒性是其发病机制之一。囊泡谷氨酸转运体(Vesicular glutamate transporters,VGLUTS)作为囊泡谷氨酸填充的决定因素,使得VGLUTs在AD的兴奋性毒性发病机制中发挥重要作用。SAMP8小鼠是研究散发型AD发病机制的一个良好模型。已有研究表明,SAMP8小鼠脑中的神经信号传递发生异常,包括氨基酸能和单胺能神经系统。本实验室之前的研究结果表明,LW-AFC可减少遗传相关AD动物模型APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ斑块,降低Aβ40和Aβ42的含量,减轻神经元的丢失,改善学习记忆能力损害,并能够改善老化相关AD动物模型SAMP8小鼠的学习记忆能力,但其是否是通过调节AD模型小鼠脑中的谷氨酸能神经系统的功能来发挥作用却并不清楚。本研究通过观察LW-AFC能否引起SAMP8小鼠主管学习记忆的关键脑区-海马中Glu等神经递质含量的变化,研究LW-AFC对SAM P8小鼠脑中谷氨酸能神经系统的异常是否具有调节作用,并通过观察LW-AFC对谷氨酸能系统中的突触后受体、突触间隙Glu的清除、Glu的再合成以及囊泡Glu转运蛋白VGLUTs的影响,来研究LW-AFC调节谷氨酸能神经系统异常的具体机制。本研究以SAMP8小鼠为AD模型,SAMR1小鼠为对照,首先通过微透析联合HPLC-ECD方法,检测海马组织间液神经递质的含量及其随昼夜及增龄的动态变化,以观察SAMP8小鼠脑中谷氨酸能神经传递的异常;其次,采用Western blot方法检测海马中突触前囊泡Glu转运蛋白VGLUTs及降解其的酶、突触后NMDA和AMPA受体、清除突触间隙Glu的EAATs、再合成Glu的GS和Glutaminase以及转运Gln的SN1和SAT1的表达,以研究SAMP8脑中谷氨酸能神经系统异常的机制;最后,通过观察LW-AFC对SAMP8脑中Glu含量的影响,研究LW-AFC对其谷氨酸能神经系统异常的调节作用,并通过观察谷氨酸能神经传递的各个环节,揭示LW-AFC调节AD动物模型SAMP8脑中谷氨酸能神经系统异常进而改善学习记忆功能的机制。一、快速老化模型小鼠脑中谷氨酸能系统异常的观察研究1.SAM小鼠海马组织间液兴奋性神经递质的昼夜节律和增龄性变化微透析联合HPLC-电化学方法检测SAM小鼠海马组织间液神经递质含量,结果表明,SAMR1中兴奋性氨基酸类神经递质Glu含量具有明显的昼夜节律,在老年前期(3和9月龄)Glu的含量白天高、晚上低,老年期(12到18月龄)的昼夜节律则与老年前期相反。与SAMR1相比,SAMP8的Glu含量昼夜节律则发生紊乱,表现为3月龄Glu含量在晚上低,6、12、15月龄则在晚上高,9和18月龄小鼠无昼夜节律变化。Glu含量昼夜节律的AUC表明,SAMR1和SAMP8小鼠海马组织间液Glu含量均随增龄呈年龄依赖性降低,而与同月龄SAMR1小鼠相比,3和9月龄SAMP8小鼠Glu含量降低,而12月龄则升高。另外,SAMP8小鼠海马组织间液中Ser、Gln和ASP含量的昼夜节律也发生紊乱,且与同月龄SAMR1相比,多个月龄SAMP8小鼠Ser和ASP含量出现降低,而Gln含量则在6、9、15月龄SAMP8小鼠中含量升高,18月龄时降低。这些结果表明,SAMP8脑中谷氨酸能神经系统出现异常。2.SAM小鼠海马组织间液抑制性神经递质的昼夜节律和增龄性变化对于抑制性氨基酸类神经递质GABA和Gly在海马组织间液中的含量的检测结果表明,SAMR1小鼠的GABA含量在成年期白天高、晚上低,老年时白天低、晚上高,然而Gly含量仅在3月龄时表现为白天高、晚上低,此后则呈现GABA老年期的昼夜节律。SAMP8小鼠GABA和Gly含量的昼夜节律发生紊乱。GABA和Gly含量昼夜节律的AUC表明,SAMR1和SAMP8小鼠海马组织间液GABA和Gly含量均随增龄而降低,与同月龄SAMR1小鼠相比,6、15月龄SAMP8小鼠海马组织间液GABA含量降低,6、9、12月龄Gly含量均升高而15月龄则降低。3.SAM小鼠海马组织间液单胺类神经递质的昼夜节律和增龄性变化对于海马组织间液中单胺类神经递质NE、DA及其代谢产物DOPAC和HVA、5-HT及其代谢产物5-HIAA的含量的检测结果表明,SAMR1小鼠具有明显的昼夜节律,表现为在老年前期晚上升高,在老年期晚上降低,而SAMP8小鼠中这些递质含量的昼夜节律发生紊乱,多表现为晚上降低。对于单胺类神经递质的总含量,SAMR1和SAMP8均在6月龄时达到最高后随增龄依赖性降低,与同月龄SAMR1相比,SAMP8的5-HIAA含量均升高,NE含量仅在3到9月龄升高。皮尔森相关性分析结果表明,兴奋性神经递质Gln、Ser、ASP的含量、抑制性神经递质GABA、Gly与Glu的含量、单胺类神经递质NE、5-HT、DA及其代谢产物DOPAC的含量均与Glu具有正相关关系,提示AD动物模型SAMP8小鼠脑中Glu的异常除了Glu能系统自身异常原因外,其他系统也对其具有协同作用。二、快速老化模型小鼠脑中谷氨酸能系统异常的机制研究为了研究SAMP8脑中谷氨酸能神经系统异常的机制,我们检测了海马中突触前囊泡Glu转运蛋白VGLUTs及降解其的酶、突触后NMDA和AMPA受体、清除突触间隙Glu的EAATs、再合成Glu的GS和Glutaminase以及转运Gln的SN1和SAT1的表达,结果如下:VGLUT1和VGLUT2的蛋白表达在9和12月龄SAMR1小鼠海马增加,随后降低,而在SAMP8中随增龄表达下降,且与同月龄SAMR1小鼠相比,VGLUT1的表达均下调,而VGLUT2在12月龄后均显著下调。Calpain和Caspase3是降解VGLUTs的酶,检测结果表明,SAMP8小鼠海马中Calpain蛋白的表达量无显著性变化,Caspase3的表达量显著增加。该结果说明,SAMP8脑中VGLUTs表达降低,而Caspase3的增加是其可能的原因。与SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠海马中NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR2C、NMDAR2D蛋白的表达均降低,AMPA2蛋白的表达升高,AMPA1蛋白的表达无显著性变化,说明谷氨酸能神经传递的突触后受体减少了。SAMP8小鼠海马中EAAT1和EAAT2蛋白表达降低,EAAT3蛋白表达无显著性变化,该结果说明清除突触间隙Glu的转运体减少了。与SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠海马中SN1、谷氨酰胺酶和GS蛋白表达降低,SAT1蛋白的表达升高,说明Glu的再合成减少了。以上结果提示,AD动物模型SAMP8小鼠海马组织间液中Glu含量上升可能是由于突触后受体和清除突触间隙Glu的转运体减少引起的,而突触前囊泡膜上VGLUTs减少一方面可能是由于Caspase3的增加,另一方面可能是Glu再合成减少引起的反馈造成的。三、LW-AFC对快速老化模型小鼠脑中谷氨酸能系统异常的调节作用研究灌胃给予7月龄雄性SAMP8小鼠LW-AFC(1.6g/kg)198天,可使SAMP8小鼠海马中VGLUT1和Calpain蛋白表达增加、Caspase3蛋白表达减少,同时可使突触后受体NMDANR 1、NMDANR2A、NMDANR2B、NMDANR2C、NMDANR2D以及AMPA1、AMPA2的蛋白表达上调,清除突触间隙Glu的EAAT2蛋白表达升高,也可使谷氨酰胺酶、SN1和SAT1蛋白表达增多。该结果说明,LW-AFC对AD模型小鼠脑中谷氨酸能系统的异常具有调节作用。选择含有LW-AFC中主要入脑成分的活性部位LWD-b进一步研究的结果表明,灌胃给予SAMP8小鼠LWD-b(0.216g/kg)可增加SAMP8小鼠海马中VGLUT1和VGLUT2蛋白的表达,减少Caspase3的蛋白表达,并下调EAAT1和EAAT2蛋白的表达,上调NMDANR1的蛋白表达。通过以上研究,本研究主要得出以下结论:(1)AD模型小鼠SAMP8小鼠脑中谷氨酸能系统发生异常,表现为海马组织间液中兴奋性氨基酸Glu、Ser、Gln和ASP含量昼夜节律紊乱,Glu含量增加,抑制性神经递质GABA、Gly、单胺类神经递质NE、5-HT、DA及其代谢产物DOPAC的异常对谷氨酸能系统异常可能与Glu具有协同作用。(2)AD动物模型SAMP8小鼠谷氨酸能系统异常的机制一方面在于突触后受体和清除突触间隙Glu的转运体减少引起海马组织间液中Glu含量上升,另一方面在于Caspase3的增加和Glu再合成减少引起的反馈所造成突触前囊泡膜上VGLUTs减少。(3)LW-AFC对AD模型小鼠脑中谷氨酸能系统的异常具有调节作用,可通过增加突触囊泡膜上VGLUT1、减少Caspase3蛋白表达,上调突触后受体、清除突触间隙Glu的转运体以及使Glu再合成相关的分子表达增多来实现。