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第一部分脑外伤后脑水肿形成机制的研究 目的：通过研究大鼠脑外伤(traumatic brain injury，TBI)后，水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)和水通道蛋白9(aquaporins9，AQP9)在脑组织中表达变化的时空规律以及脑水肿的变化规律，探讨AQP4，9在TBI后脑水肿的形成、发展及转归中的作用，为临床治疗脑水肿提供实验依据。 方法：健康成年雄性SD大鼠651只，随机分为脑外伤组、对照组和正常组，采用改良加速冲击法制作重度脑外伤模型，对照组除不用击锤打击钉帽外，其余步骤与脑外伤组相同。每组于1、3、6、12、24、48、72 h和1周取材，采用光镜、电镜对相应部位进行病理观察，TTC(2，3，5-Tripheny1，2-H-Tetrazolum chloride)染色观察脑组织的缺血程度，伊文氏蓝(Evans Blue，EB)测定法检测血脑屏障(blood brainbarrier，BBB)的损伤程度，干湿重法计算脑组织含水量变化，免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)、免疫荧光(Immunofluorence，IF)观察各组相应时间点脑组织AQP4，9的表达变化，免疫印迹(western-blot)、PCR测定各组相应时间点脑组织AQP4，9含量的变化。 结果：在假手术对照组，脑组织形态、TTC染色、EB检测均与正常组无明显差别；术后6-12h，脑含水量增加，电子显微镜观察显示此时大脑皮质内部分星胶肿胀，以6h为甚；免疫组化、免疫双标、免疫印迹及PCR显示，术后6h，AQP4表达降低，AQP9表达增高。在TBI组中，光镜观察发现，打击处大脑皮质损伤明显，至48-72 h损伤区域明显扩大，大脑皮质组织肿胀，结构模糊不清。TTC检测显示，1-6h脑缺血灶不明显，24h缺血灶仅局限在打击处，至72 、h局部缺血灶达最大面积，但直至1w，未出现大面积缺血灶。EB检测显示，伤侧大脑EB含量于1h明显增高，6h达峰值，后逐渐递减，至72h及以后时段与对照组无明显差别。伤侧大脑皮质含水量，于伤后1 h明显增高，并于6 h含水量达到峰值，之后略有减轻，但仍明显高于对照组和正常组，72h达次峰值，直至1w仍未恢复正常水平。免疫组化及免疫荧光检测显示，AOP4于TBI早期在血管周围、软脑膜下、室管膜下表达明显增强，24 h后除上述部位外，其阳性细胞广泛存在于大脑皮质内；TBI早期可见大脑内散在的AOP9阳性细胞，24 h后其阳性星形胶质细胞广泛存在于脑内，且在下丘脑可见阳性表达的神经元。免疫印迹和PCR显示，AQP4表达于伤后1 、h明显增加，6h后有所下降，但仍明显高于对照组，之后其表达继续增加，于48-72h达峰值，直至1w仍未恢复到正常水平；AOP9的表达从伤后开始上调，于6h达次峰值，在随后的轻度下降后，再次增高，至72h达峰值，1w仍高于正常水平(P<0.05)。 结论：TBI早期，BBB严重受损造成细胞外水肿，AOP4表达改变可能与细胞外液清除有关，AOP9表达的上调可能与应激反应和细胞水肿有关。此时期以细胞外水肿为主，同时存在细胞水肿。TBI继发损伤期，BBB损伤逐渐减轻，AQP4表达上调与细胞水肿的形成有关，AQP9在此期的表达上调可能与能量代谢的调节和细胞水肿的形成有关。此时脑水肿以细胞水肿为主，兼有细胞外水肿。 第二部分 AQP4锚定机制的研究 目的：探讨AQP4与其锚定蛋白的表达及分布变化之间的关系，初步研究TBI后AQP4锚定机制的改变与外伤性脑水肿的关系。 方法：成年健康雄性SD(sprague-dawley)大鼠186只，随机分为脑外伤组和对照组，采用改良加速冲击法制作重度脑外伤模型，对照组除不用击锤打击钉帽外，其余布步骤与脑外伤组相同。每组于1、3、6、12、24、48、72 h和1周取材；新生SD大鼠(2d内)84只，取大脑皮层进行星形胶质细胞原代培养，随机分为对照组和划伤组，每组分别于1、3、6、12、24、48、72 h取材。通过HE、尼氏染色观察脑外伤后离体和在体模型的病理变化。用免疫荧光标记法检测AQP4及其锚定相关蛋白α-syntrophin，laminin，Agrin在TBI后脑组织及划伤后星形胶质细胞的表达及分布变化。用免疫印迹法检测AQP4及其锚定相关蛋白α-syntrophin，laminin，agrin在TBI后大脑皮质及划伤后星形胶质细胞的表达变化。 结果：在体实验中，对照组AQP4于TBI后6 h在伤侧皮质表达降低，其锚定相关蛋白的表达变化无明显异常。TBI组中，免疫荧光显示AQP4、α-syntrophin于TBI早期(1-12 h)，在血管周围、软脑膜下、室管膜下表达明显增强，24 h后除上述部位外，其阳性细胞广泛存在于大脑皮质内，二者共表达；laminin，agrin于TBI早期，在脑内部分血管周围、软脑膜及室管膜下区域表达明显增强，24 h后可见大脑皮质内星形胶质细胞的阳性表达，且与AQP4共表达。免疫荧光及免疫印迹显示，AQP4及其锚定相关蛋白表达变化规律基本一致，均于TBI后1-3 h明显增加，6 h表达下调，随后逐渐增加，至48-72 h达峰值，1 w仍高于正常组；AQP4与其各个锚定相关蛋白之间均呈正相关。离体实验中，光镜观察显示，划伤后星形胶质细胞轴突断裂、细胞破裂。免疫荧光显示，AQP4、laminin、agrin在划伤后3 h表达明显增高，且随时间延长而递增，三者共表达于胞膜，12 h后，于足突断端可见三者表达较胞膜明显增高；α-syntrophin表达于星胶的胞浆或/和胞核内，12 h后其表达明显增强，其部分阳性细胞与AQP4共表达。免疫荧光及免疫印迹显示，AQP4、laminin、agrin在划伤后3 h明显上调，之后逐渐增高，至48-72 h达峰值；α-syntrophin在划伤后3 h表达下调，6 h恢复至正常水平，之后逐渐增加，至48 h达峰值。 结论：TBI后，AQP4及其锚定相关蛋白α-syntrophin、laminin、agrin的表达分布均发生改变；AQP4锚定机制的改变与AQP4的表达及分布改变，以及脑外伤后脑水肿的形成有关。