论文部分内容阅读
酶固定化技术是20世纪60年代兴起的,在21世纪初期得到长足发展的一项高新生物技术工程。在酶固定化技术中,固定化载体对酶固定化后的酶活性高低,以及固定化酶的应用方面有着显著的影响。本实验综合固定化酶活性的高低和固定化酶的应用等因素考虑,以树脂为载体来固定化多酚氧化酶,并对固定化多酚氧化酶的性质,以及固定化多酚氧化酶催化茶多酚形成茶黄素开展了研究。1对不同孔径,材质和极性的大孔吸附树脂和离子交换树脂载体进行了筛选,实验结果表明,在对多酚氧化酶的固定化效果方面,阳离子交换树脂载体优于大孔吸附树脂载体和阴离子交换树脂载体。在阳离子交换树脂载体中,又以树脂载体D152效果最理想。2对树脂载体D152固定化多酚氧化酶的条件进行了优化,得到最优固定化条件:10.00g经处理的树脂载体D152,加入0.2mg/ml的多酚氧化酶溶液50ml,在4℃下,120rpm下吸附固定化2h,之后,加入0.080ml 25%戊二醛溶液, 120rpm下交联1h。3对固定化多酚氧化酶的性质进行了研究。(1)固定化多酚氧化酶的Km值为0.113mg/ml,较SPPO增大了17.6%;(2)4℃下多酚氧化酶的半衰期由17.2天增加到52.5天,提高3倍;(3)固定化多酚氧化酶具有较好的重复使用稳定性,重复使用20次后,酶活力保留40%以上;(4)固定化多酚氧化酶的最适pH较多酚氧化酶向碱移1个单位,最适反应温度提高5℃;(5)固定化多酚氧化酶在有机溶剂中的稳定性明显优于游离态多酚氧化酶;(6)固定化酶多酚氧化酶对金属离子的抗性较游离多酚氧化酶没有明显的变化;(7)固定化酶多酚氧化酶柱具有很好的淋洗稳定性。4将固定化多酚氧化酶应用于茶黄素的制备中,对实验主要影响因素:温度(X1),pH(X2),底物浓度(X3),反应时间(X4)和通氧量(X5),采用正交实验设计处理,对实验结果进行多项式回归方程拟合,得到多项式回归方程:Y=-0.4366+0.0186X1+0.1065X2-0.1121X3+3.6350X5-0.0002X1*X1 -0.0034X3*X3+0.0003X4*X4+0.4025X5*X5-0.0034X1*X2+0.0034X1*X3-0.0623X1*X5+0.0149X2*X3-0.0012X3*X4-0.0328X4*X5,R2=0.9998,结合多项式回归方程,对整个实验因素的最优方案进行优选,得出最佳实验处理组合:温度=64.6℃,pH=6.57,底物浓度=11.53mg/ml,反应时间=59.7min,通氧量=0.10L/min,将此组合代入回归方程,得到Y=1.03mg/ml。以以上因素水平组合,进行实验检验,得到茶黄素产量(0.90±0.06)mg/ml,验证准确率达到87.46%。