目的:目前,随着生活习惯和饮食结构的变化,结直肠癌发病增多,约有1/ 3的患者发现时已属晚期,且手术后常有转移,因此探讨其发生机制,寻找有效的预防措施和对癌变的早期发现、早期诊断、早期治疗的方法是降低其发病率和死亡率的关键。在结直肠癌发病机制的研究中环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和错配修复(Mismatch Repair,MMR)系统是两个比较重要的靶点。前期研究[1,9]发现COX-2蛋白表达阳性的胃癌和结肠癌标本中几乎没有错配修复酶的缺乏;而错配修复酶的缺乏主要发生在COX-2蛋白低表达的标本中,提示可能其发生机制不同。COX-2是合成前列腺素的限速酶,可以通过参与调控细胞增殖、分化,抑制细胞凋亡等途径促进肿瘤的发生和发展。COX-2抑制细胞凋亡的作用与凋亡抑制蛋白B细胞淋巴瘤2(B Cell Leukemia 2,Bcl-2)高表达相关。胱冬肽酶(Caspartate-specific cysteinyl proteinase, caspase),尤其是caspase-3对Bcl-2家族蛋白具有重要的酶解修饰作用,是细胞凋亡过程中的关键部分。遗传性DNA修复调节基因突变或缺失的人群,肿瘤的发病率很高。错配修复是DNA修复调节的一种,它可以通过纠正DNA复制过程中发生的碱基错配以维持基因组稳定。其中hMLH1、hMSH2基因是MMR系统的两个最重要成员,它们的编码蛋白在DNA错配修复过程中发挥着重要的作用。hMLH1、hMSH2蛋白表达降低和功能缺失可引起基因组微卫星不稳定(Microsatellite instability, MSI),使整个基因组稳定性下降,随机突变率增高,导致一系列肿瘤相关靶基因改变而致肿瘤发生。流行病学研究发现,长期服用非甾体类抗炎药(non-steroidal anti -inflammatory drugs,NSAIDs)可减少结直肠癌、食管癌、胃癌和胰腺癌等消化道肿瘤的危险性[2],NSAIDs对胃肠道肿瘤有一定的化学预防作用。大量实验证据表明,诱导凋亡和影响细胞生长周期是NSAIDs以环氧化酶或非环氧化酶介导途径预防肿瘤的主要方式,其中以凋亡作用最显著。许多研究发现,NSAIDs抗肿瘤作用主要通过抑制COX-2表达,抑制前列腺素产物活性或数量,引起凋亡蛋白和抗凋亡蛋白变化,最终诱导细胞凋亡增加而实现的,这是COX-2介导的凋亡途径。而非COX-2途径主要是NSAIDs通过影响核因子κB信号转导等通路,或上调凋亡前体蛋白,抑制血管生成等途径发挥作用。阿斯匹林和舒林酸[3]作用于错配修复酶缺陷的结肠癌细胞株,可以显著减少其MSI表型,预防大肠息肉向癌的转化,甚至逆转早期大肠癌,通过影响MMR系统蛋白的表达也是NSAIDs抗肿瘤的另一途径。本研究应用选择性环氧化酶抑制剂戊地昔布(Valdecoxib)和非选择性环氧化酶抑制剂阿司匹林(Aspirin)作用于COX-2高表达MSI阳性(hMSH2表达缺失)的人结肠癌lovo细胞株,通过流式细胞术、免疫细胞化学染色、Western blot等方法,观察两种药物对lovo细胞增殖、凋亡和细胞周期及COX-2、Bcl-2、caspase-3、hMLH1、hMSH2蛋白表达的影响,初步探讨不同NSAIDs的预防和治疗机制,以期为结直肠癌的发生、预防及合理治疗提供理论依据和实验基础。方法:1材料:人结肠癌lovo细胞株:COX-2高表达,MSI阳性(hMSH2表达缺失);应用选择性环氧化酶抑制剂Valdecoxib和非选择性环氧化酶抑制剂Aspirin作干预因素。2方法:2.1用甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定各组lovo细胞株的增殖情况,以确定半数抑制浓度(IC50):设立空白对照组(control)、溶剂对照组(solvent)、药物组;药物浓度为25μmol.L-1、50μmol.L-1、100μmol.L-1、200μmol.L-1; 400μmol.L-1、800μmol.L-1。作用时间:72h,测定IOD值,计算细胞生长抑制率,根据公式确定IC50。2.2实验分组:2.2.1浓度分组:根据IC50分别选取两种药物的三个不同浓度,Aspirin: 90μmol.L-1、180μmol.L-1、360μmol.L-1; Valdecoxib: 20μmol.L-1、40μmol.L-1、80μmol.L-1作用于lovo细胞株72 h。2.2.2时间分组:选取两种药物IC50浓度作用于lovo细胞株24 h、48 h、72 h收集细胞。2.3检测指标:2.3.1流式细胞定量检测技术(FCM)检测按浓度分组和时间分组的各组细胞凋亡和细胞周期的变化。2.3.2应用蛋白免疫印迹(Western Blot)的方法检测药物按时间分组后各组细胞COX-2、hMLH1、hMSH2、Bcl-2、caspase-3蛋白的表达情况。并应用免疫细胞化学(SP法)观察COX-2、hMLH1、hMSH2蛋白的表达位置及变化。结果:1 Aspirin、Valdecoxib对lovo细胞株增殖的影响Valdecoxib和Aspirin作用于人结肠癌lovo细胞株72h,IC50分别为86.30μmol.L-1和382.46μmol.L-1。两种药物对lovo增殖均有抑制作用,并且随着药物浓度的增加,抑制作用逐渐增强。Valdecoxib的抑制作用强于Aspirin。溶剂对细胞的生长未见明显影响。(Fig.1)2 Aspirin、Valdecoxib对lovo细胞株凋亡的影响FCM检测显示两种药物均可诱导lovo细胞凋亡增加,细胞DNA直方图二倍体峰前均可见凋亡细胞特征性的亚二倍体峰,对照组未见明显凋亡峰。Valdecoxib作用24、48和72h的凋亡率分别为(4.26±0.71)%、(29.03±0.64)%和(39.96±1.40)%,均高于对照组;不同浓度的Valdecoxib作用72h,凋亡率分别为(8.39±0.33)%、(8.08±0.42)%和(28.9±1.62)%,其中80μmol.L-1组的凋亡率增加显著(p<0.05)。Aspirin组的24、48和72h的凋亡率分别(6.41±0.33)%、(28.73±0.45)%和(32.41±0.69)%,均高于对照组;不同浓度Aspirin作用72h,其中180和360μmol.L-1组的凋亡率显著增加为(23.6±0.85)%和(28.0±1.28)%,高于对照组(0.92±0.35)%。药物以IC50浓度作用48h和72h后,Valdecoxib诱导的lovo细胞凋亡率高于Aspirin,其差异具有统计学意义(p<0.05)。不同浓度药物作用72h,两种药物比较,细胞凋亡无明显差异(p>0.05)(Table.2,Table.3)。3 Aspirin、Valdecoxib对体外培养lovo细胞周期的影响。以两种药物的不同浓度作用于lovo细胞72h ,可见Valdecoxib80μmol.L-1组中和Aspirin360μmol.L-1组lovo细胞G0/G1期细胞数增加为(74.61±1.63)%和(67.38±1.64)%,S期和G2/M期细胞数减少,增殖指数PI出现下降,与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。两种药物以IC50作用不同时间后,Valdecoxib在72h组、Aspirin在48h和72h组,G0/G1期细胞数增加明显,S期和G2/M期细胞数减少,PI下降明显。Valdecoxib作用明显强于Aspirin,两药物组与对照组比较,均有显著性差异(P<0.05)。由此可见,Aspirin、Valdecoxib可以将lovo细胞阻滞于G0/G1期。4免疫细胞化学观察Aspirin、Valdecoxib对lovo细胞COX-2、hMLH1和hMSH2蛋白表达的影响光镜下观察lovo细胞中COX-2为细胞浆和核膜着色,hMLH1主要为核着色,hMSH2为阴性表达。(Fig. 5,6)随着Aspirin、Valdecoxib作用时间的延长,COX-2蛋白表达逐渐减少,Valdecoxib作用强于Aspirin。hMLH1蛋白72h表达明显增多,Aspirin作用强于Valdecoxib。hMSH2蛋白未见阳性表达。5 Western-blot检测Aspirin、Valdecoxib对lovo细胞COX-2、hMLH1和hMSH2蛋白以及凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3的影响COX-2、hMLH1、hMSH2、Bcl-2、caspase-3蛋白分子量分别为72kD、85kD、110kD、26kD、32kD,Western杂交后在相应位置出现阳性条带。采用凝胶成像分析系统对杂交条带进行半定量分析,蛋白含量以IOD表示,以β-actin蛋白为内参,以相对积分光密度比较蛋白表达的高低。Valdecoxib对COX-2蛋白表达影响随药物作用时间延长其抑制作用逐渐增强,48h和72h作用最明显(p<0.05);而Aspirin只在作用72h时,明显抑制COX-2蛋白表达。Valdecoxib抑制作用强于Aspirin。两种药物作用对lovo细胞hMSH2蛋白表达未见影响。Valdecoxib在作用于lovo细胞72h,Aspirin在作用48h时,hMLH1蛋白表达量增高明显(P<0.05)。Aspirin作用强于Valdecoxib。(Fig.10)。Valdecoxib和Aspirin抑制Bcl-2蛋白表达随作用时间的延长,表达量逐渐减少,而caspase-3蛋白随着时间的延长表达量增加,以48h和72h作用明显(P<0.05)。Valdecoxib对Bcl-2蛋白的抑制作用强于Aspirin,但对caspase-3蛋白表达影响无明显差别(p>0.05)。结论:1 NSAIDs对人结肠癌lovo细胞株生长的抑制作用呈时间和剂量依赖性,抑制细胞增殖与诱导细胞凋亡,延长细胞周期有关。2 NSAIDs可以诱导hMLH1蛋白表达增加,而对缺乏hMSH2蛋白的lovo细胞株,hMSH2未见变化。3 NSAIDs主要通过抑制COX-2蛋白,进而减少抗凋亡蛋白Bcl-2表达、增加caspase-3表达,促进细胞凋亡。还可通过影响MMR维护DNA修复调节功能,促使肿瘤细胞凋亡。4选择性环氧化酶抑制剂Valdecoxib抑制生长、诱导凋亡、阻滞周期和抑制COX-2的作用均强于非选择性环氧化酶抑制剂Aspirin。但Aspirin诱导lovo细胞中hMLH1蛋白表达增加的作用强于Valdecoxib,再次提示了结直肠癌的发生可能存在不同的机制。