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体细胞核移植技术尽管在许多哺乳动物已获得了成功,但克隆效率偏低仍然制约着该技术的应用。供体细胞周期调控是提高核移植效率的重要途径之一,因供体和受体细胞的细胞周期协调与克隆效率关系非常密切。Rapamycin是一种mTOR(mammalian target of rapamycin,mTOR)蛋白特异性抑制剂,能阻断细胞由G1至S期的进程,将细胞周期静止在G1期。因此,本研究探讨了Rapamycin和血清饥饿对BEF细胞周期和体细胞核移植胚胎发育能力的影响,旨在寻找一种合适的供体细胞同期化方法,为提高水牛体细胞克隆效率提供理论和技术依据。首先,比较了不同浓度Rapamycin(0,0.5,1,2,4μM)处理对BEF细胞周期和活力的影响。结果发现,11μM Rapamycin处理组细胞的活力及G0/G1期的比例显著高于对照组和其他试验组(P<0.05)。比较Rapamycin处理BEF不同时间(0、48、72、96 h)对细胞周期的影响结果显示:1μM Rapamycin处理BEF 72 h和96 h细胞G0/G1期比例显著高于其他组(P<0.05)。其次,比较了Rapamycin和血清饥饿法处理对BEF细胞周期的影响。结果发现,Rapamycin同期化效率显著高于血清饥饿法(P<0.05);qPCR结果显示,Rapamycin和血清饥饿处理均能显著下调CyclinD1、Cyclin基因的表达(P<0.05),上调p27的表达水平(P<0.05),但是Rapamycin组p27的表达水平显著高于血清饥饿组(P<0.05);而且Rapamycin还显著下调了CDK2 的表达(P<0.05);Western blot结果显示,Rapamycin和血清饥饿都增加了p27蛋白的表达水平(P<0.05),降低了CyclinDl蛋白表达(P<0.05),但是Rapamycin也显著抑制了mTOR蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。接着,探究了Rapamycin和血清饥饿法处理对BEF生理特征的影响。Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡结果发现:血清饥饿组凋亡水平显著高于Rapamycin组(P<0.05);qPCR结果显示,Rapamycin显著上调了抑凋亡基因Bcl-2的表达水平(P<0.05),显著下调了促凋亡基因Casepase3、Casepase9的表达(P<0.05),而血清饥饿组显著上调了促凋亡基因Bad的表达水平(P<0.05);细胞活性氧检测发现,与Rapamycin处理组相比,血清饥饿处理显著增加了细胞ROS水平(P<0.05);对BEF细胞代谢相关基因表达的检测发现,Rapamycin处理组显著上调了代谢相关基因ACADVL、Ass、HMGCL的表达水平(P<0.05)。此外,BEF经Rapamycin处理后细胞具有正常染色体倍数的细胞比例显著高于血清饥饿组(P<0.05)。最后,比较了Rapamycin和血清饥饿处理BEF对其核移植后胚胎发育能力的影响。结果发现,BEF经Rapamycin处理用作供体细胞进行核移植,核移植胚胎的8细胞率和囊胚率显著高于血清饥饿组和对照组(P<0.05)。以上结果表明,(1)适宜浓度(1μM)的Rapamycin处理水牛耳部成纤维细胞一定时间(72 h)能够提高细胞活力和G0/G1期的比例。(2)Rapamycin处理水牛耳部成纤维细胞后G0/G1期的比例显著高于血清饥饿法,这一作用可能是因为Rapamycin通过抑制mTOR磷酸化水平影响了细胞周期相关基因的表达所致。(3)Rapamycin处理水牛耳部成纤维细胞后凋亡水平显著低于血清饥饿组,推测可能和Rapamycin降低细胞ROS水平、调控体内代谢有关。(4)Rapamycin显著提高了核移植胚胎发育能力,这一作用可能与Rapamycin提高BEF G0/G1期比例和细胞活力有关。