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背景与目的
金属暴露对不孕女性生殖健康及子代发育有重要影响，但以往研究探究单一或少数几类金属的生物效应为主，且多以血液、尿液作为暴露检测生物样本，存在局限，因此，开展针对不孕女性多金属暴露、多生物样本分析并建立长期随访队列研究，以评价多金属暴露影响不孕女性生殖健康显得尤为重要。本研究的主要目的是：(1)探究不孕女性卵泡液多金属暴露水平与卵巢功能相关指标的关联；(2)探究不孕女性卵泡液多金属暴露水平与ART结局的关联；(3)探究不孕女性卵泡液多金属暴露水平与子代生长发育相关指标的关联。
材料和方法
本文以不孕女性及其子代作为研究对象，招募2017年9月至2018年1月间在浙江大学医学院附属妇产科医院接受辅助生育技术(Assisted Reproductive Technology, ART)治疗的不孕女性，于不孕门诊期间采集其促排卵启动前月经期1~3天血液，于取卵手术住院期间采集其卵泡液及尿液以检测其中金属含量。本研究共检测了19种金属元素(钒V、铬Cr、锰Mn、铁Fe、钴Co、镍Ni、铜Cu、锌Zn、砷As、硒Se、锶Sr、钼Mo、银Ag、镉Cd、锡Sn、锑Sb、钡Ba、铊Tl、铅Pb)水平。
为探究卵泡液多金属水平与不孕女性卵巢功能指标的关联性，本学位论文通过医院病历系统获取患者卵巢功能指标如抗穆勒氏管激素(Anti Mullerian Hormone, AMH)、月经来潮1~3天基础内分泌水平卵泡刺激素(Follicle-Stimulating Hormone, FSH)、黄体生成素(Luteinizing Hormone, LH)、雌激素(Estrogen, E2)、泌乳素(Prolactin, PRL)、孕激素(Progesterone, P)、睾酮(Testosterone, T)。
为探究卵泡液多金属水平与与ART结局的关联性，本学位论文通过医院病历系统获取患者ART结局如获卵数、受精率、优胚率、妊娠率、流产率、活产率、累积妊娠率、累积流产率和累积活产率。
为探究卵泡液多金属水平与子代生长发育指标的关联性，采用电话问卷随访调查患者子代生长发育指标(出生体重、出生后3月/6月/12月身高、体重及头围)。
使用单金属模型和多金属模型分析卵泡液金属水平与女性卵巢功能指标、ART结局和子代生长发育指标之间的关联性。金属水平四分位数(quartiles)作为自变量拟合线性回归模型，并校正年龄、孕前BMI、孕周(仅对子代)、子代性别(仅对子代)、地域、收入、学历、职业、饮水习惯、饮酒习惯、被动吸烟情况等可能混杂因素，每种金属分别进行模型拟合分析。对金属四分位数临床指标之间关联性趋势检验p进行FDR校正。针对各临床指标，选择单金属模型FDR校正p<0.05的金属，全部纳入线性模型彼此校正，同时校正与单金属模型中相同的可能混杂因素，构建多金属模型。
结果
本研究为单中心队列研究，共纳入987名接受辅助生殖技术的不孕女性及434名子代，收取915份卵泡液样品、966份尿液样品及624份血液样品。接受辅助生殖技术的不孕女性的平均年龄为31.39±4.71岁，孕前体重指数为21.90±2.60kg/m2，汉族为主(95.39%)。
卵泡液多金属水平与卵巢功能指标关联性：接受辅助生殖技术的不孕女性血FSH为7.37±4.64mIU/mL，LH为5.25±3.60mIU/mL，E2为114.57±69.74mIU/mL，PRL为21.20±25.55ng/mL，P为2.06±1.78ng/mL，T为1.06±3.02ng/mL，AMH为3.74±2.57ng/mL。分析卵泡液多金属与卵巢功能指标的关联，结果显示：V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Mo与P有显著性正相关(FDR校正pV<0.001；pCr<0.001；pMn<0.001；pCo<0.001；pNi<0.001；pCu=0.005；pZn=0.002；pMo<0.001)，随着V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Mo四分位数等级水平增加，P随之增加；Mn、Ni与T有显著性正相关(FDR校正pMn=0.027；pNi=0.003)，随着Mn、Ni四分位数等级水平增加，T随之增加；Zn与AMH有显著性正相关(FDR校正p=0.010)，随着Zn四分位数等级水平增加，AMH随之增加。进一步纳入多金属模型后，Cr与P的关联性仍有显著性(p<0.001)。
卵泡液多金属水平与ART结局关联性：接受辅助生殖技术的不孕女性获卵数为10.66±6.85个，受精率为58.24±27.97(%)，优胚率为72.68±33.50(%)，妊娠率为33.7%，流产率为7.85%，活产率为25.85%，累积妊娠率为57.69%，累积流产率为13.30%，累积活产率为44.39%。分析卵泡液多金属与ART结局的关联，结果显示：Sr与获卵数有显著性正相关(FDR校正p=0.006)，随着Sr四分位数等级水平增加，获卵数随之增加。未发现其他ART结局与卵泡液多金属的显著性关联。
卵泡液多金属水平与子代生长发育指标关联性：子代平均出生体重为3.31±0.49kg，3月身高为60.95±4.15cm、体重为6.34±2.50kg、头围为39.75±2.33cm，6月身高为69.79±5.55cm、体重为7.79±1.24kg、头围为42.79±3.00cm，12月身高为74.74±7.52cm、体重为9.49±1.49kg、头围为45.24±1.49cm。分析卵泡液多金属水平与出生子代健康结局的关联，结果显示：V、Cr、Se、Ag与出生体重有显著性关联(FDR校正pV=0.003；pCr=0.001；pSe<0.001；pAg=0.004)，随着V、Cr、Se四分位数等级水平增加，出生体重随之增加，随着Ag四分位数等级水平增加，出生体重随之减少；Se与3月身长、3月体重、6月体重、6月头围、12月身长有显著性正相关(FDR校正p3月身长=0.007；p3月体重=0.011；p6月体重<0.001；p6月头围<0.001；p12月身长=0.007)，随着Se四分位数等级水平增加，3月身长、3月体重随之增加；Zn、Ag与6月体重有显著性关联性(FDR校正pZn=0.018；pAg=0.004)，随着Zn四分位数等级水平增加，6月体重随之增加，随着Ag四分位数等级水平增加，6月体重随之减少；Cr、Ag与6月头围有显著性关联性(FDR校正pCr=0.008；pAg=0.004)，随着Cr四分位数等级水平增加，6月头围随之增加，随着Ag四分位数等级水平增加，6月头围随之减少。进一步纳入多金属模型后，Se与出生体重、6月头围的关联性仍有显著性(p<0.001)。
结论
本研究调查分析了不孕女性卵泡液多金属暴露水平，单金属模型与多金属模型研究发现：(1)卵泡液Zn与血AMH、Sn与血E2、Cr与血P存在显著性正相关；(2)卵泡液Sr与获卵数存在显著性正相关；(3)卵泡液Se与子代出生体重、出生后3月身长/体重、6月头围和12月身长存在显著性正相关。
金属暴露对不孕女性生殖健康及子代发育有重要影响，但以往研究探究单一或少数几类金属的生物效应为主，且多以血液、尿液作为暴露检测生物样本，存在局限，因此，开展针对不孕女性多金属暴露、多生物样本分析并建立长期随访队列研究，以评价多金属暴露影响不孕女性生殖健康显得尤为重要。本研究的主要目的是：(1)探究不孕女性卵泡液多金属暴露水平与卵巢功能相关指标的关联；(2)探究不孕女性卵泡液多金属暴露水平与ART结局的关联；(3)探究不孕女性卵泡液多金属暴露水平与子代生长发育相关指标的关联。
材料和方法
本文以不孕女性及其子代作为研究对象，招募2017年9月至2018年1月间在浙江大学医学院附属妇产科医院接受辅助生育技术(Assisted Reproductive Technology, ART)治疗的不孕女性，于不孕门诊期间采集其促排卵启动前月经期1~3天血液，于取卵手术住院期间采集其卵泡液及尿液以检测其中金属含量。本研究共检测了19种金属元素(钒V、铬Cr、锰Mn、铁Fe、钴Co、镍Ni、铜Cu、锌Zn、砷As、硒Se、锶Sr、钼Mo、银Ag、镉Cd、锡Sn、锑Sb、钡Ba、铊Tl、铅Pb)水平。
为探究卵泡液多金属水平与不孕女性卵巢功能指标的关联性，本学位论文通过医院病历系统获取患者卵巢功能指标如抗穆勒氏管激素(Anti Mullerian Hormone, AMH)、月经来潮1~3天基础内分泌水平卵泡刺激素(Follicle-Stimulating Hormone, FSH)、黄体生成素(Luteinizing Hormone, LH)、雌激素(Estrogen, E2)、泌乳素(Prolactin, PRL)、孕激素(Progesterone, P)、睾酮(Testosterone, T)。
为探究卵泡液多金属水平与与ART结局的关联性，本学位论文通过医院病历系统获取患者ART结局如获卵数、受精率、优胚率、妊娠率、流产率、活产率、累积妊娠率、累积流产率和累积活产率。
为探究卵泡液多金属水平与子代生长发育指标的关联性，采用电话问卷随访调查患者子代生长发育指标(出生体重、出生后3月/6月/12月身高、体重及头围)。
使用单金属模型和多金属模型分析卵泡液金属水平与女性卵巢功能指标、ART结局和子代生长发育指标之间的关联性。金属水平四分位数(quartiles)作为自变量拟合线性回归模型，并校正年龄、孕前BMI、孕周(仅对子代)、子代性别(仅对子代)、地域、收入、学历、职业、饮水习惯、饮酒习惯、被动吸烟情况等可能混杂因素，每种金属分别进行模型拟合分析。对金属四分位数临床指标之间关联性趋势检验p进行FDR校正。针对各临床指标，选择单金属模型FDR校正p<0.05的金属，全部纳入线性模型彼此校正，同时校正与单金属模型中相同的可能混杂因素，构建多金属模型。
结果
本研究为单中心队列研究，共纳入987名接受辅助生殖技术的不孕女性及434名子代，收取915份卵泡液样品、966份尿液样品及624份血液样品。接受辅助生殖技术的不孕女性的平均年龄为31.39±4.71岁，孕前体重指数为21.90±2.60kg/m2，汉族为主(95.39%)。
卵泡液多金属水平与卵巢功能指标关联性：接受辅助生殖技术的不孕女性血FSH为7.37±4.64mIU/mL，LH为5.25±3.60mIU/mL，E2为114.57±69.74mIU/mL，PRL为21.20±25.55ng/mL，P为2.06±1.78ng/mL，T为1.06±3.02ng/mL，AMH为3.74±2.57ng/mL。分析卵泡液多金属与卵巢功能指标的关联，结果显示：V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Mo与P有显著性正相关(FDR校正pV<0.001；pCr<0.001；pMn<0.001；pCo<0.001；pNi<0.001；pCu=0.005；pZn=0.002；pMo<0.001)，随着V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Mo四分位数等级水平增加，P随之增加；Mn、Ni与T有显著性正相关(FDR校正pMn=0.027；pNi=0.003)，随着Mn、Ni四分位数等级水平增加，T随之增加；Zn与AMH有显著性正相关(FDR校正p=0.010)，随着Zn四分位数等级水平增加，AMH随之增加。进一步纳入多金属模型后，Cr与P的关联性仍有显著性(p<0.001)。
卵泡液多金属水平与ART结局关联性：接受辅助生殖技术的不孕女性获卵数为10.66±6.85个，受精率为58.24±27.97(%)，优胚率为72.68±33.50(%)，妊娠率为33.7%，流产率为7.85%，活产率为25.85%，累积妊娠率为57.69%，累积流产率为13.30%，累积活产率为44.39%。分析卵泡液多金属与ART结局的关联，结果显示：Sr与获卵数有显著性正相关(FDR校正p=0.006)，随着Sr四分位数等级水平增加，获卵数随之增加。未发现其他ART结局与卵泡液多金属的显著性关联。
卵泡液多金属水平与子代生长发育指标关联性：子代平均出生体重为3.31±0.49kg，3月身高为60.95±4.15cm、体重为6.34±2.50kg、头围为39.75±2.33cm，6月身高为69.79±5.55cm、体重为7.79±1.24kg、头围为42.79±3.00cm，12月身高为74.74±7.52cm、体重为9.49±1.49kg、头围为45.24±1.49cm。分析卵泡液多金属水平与出生子代健康结局的关联，结果显示：V、Cr、Se、Ag与出生体重有显著性关联(FDR校正pV=0.003；pCr=0.001；pSe<0.001；pAg=0.004)，随着V、Cr、Se四分位数等级水平增加，出生体重随之增加，随着Ag四分位数等级水平增加，出生体重随之减少；Se与3月身长、3月体重、6月体重、6月头围、12月身长有显著性正相关(FDR校正p3月身长=0.007；p3月体重=0.011；p6月体重<0.001；p6月头围<0.001；p12月身长=0.007)，随着Se四分位数等级水平增加，3月身长、3月体重随之增加；Zn、Ag与6月体重有显著性关联性(FDR校正pZn=0.018；pAg=0.004)，随着Zn四分位数等级水平增加，6月体重随之增加，随着Ag四分位数等级水平增加，6月体重随之减少；Cr、Ag与6月头围有显著性关联性(FDR校正pCr=0.008；pAg=0.004)，随着Cr四分位数等级水平增加，6月头围随之增加，随着Ag四分位数等级水平增加，6月头围随之减少。进一步纳入多金属模型后，Se与出生体重、6月头围的关联性仍有显著性(p<0.001)。
结论
本研究调查分析了不孕女性卵泡液多金属暴露水平，单金属模型与多金属模型研究发现：(1)卵泡液Zn与血AMH、Sn与血E2、Cr与血P存在显著性正相关；(2)卵泡液Sr与获卵数存在显著性正相关；(3)卵泡液Se与子代出生体重、出生后3月身长/体重、6月头围和12月身长存在显著性正相关。