禽巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的一种接触性败血性传染病,感染对象为鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类,通常出现以急性型发病为主,呈现高感染率和高死亡率。目前,预防禽霍乱主要依赖于抗生素、灭活苗、弱毒苗和亚单位疫苗等。抗生素易产生耐药性,而其它疫苗免疫效果不佳。迟迟不能研发出理想的疫苗,究其原因,这可能与忽略先天性免疫,特别是对巴氏杆菌感染的先天免疫机制的认识不足有关。为了解禽源多杀性巴氏杆菌C48-1感染家禽的先天免疫机制,本研究首先建立了检测ChTLRs、信号传导分子和炎性细胞因子荧光定量PCR方法;用其检测C48-1感染HD11细胞和雏鸡后ChTLRs表达量变化情况,寻找识别C48-1的Toll样受体;接着使用RNA干扰技术对ChTLR进行基因沉默,研究ChTLR对下游相关信号分子和炎性细胞因子调控作用;再利用Western blotting技术检测C48-1对MAPK家族和NF-κB的活化情况;最后使用蛋白抑制剂分别阻断MAPK家族和NF-κB信号通路,研究P38MAPK、JNK、ERK和NF-κB对炎性细胞因子的调控作用。研究结果表明:(1)成功建立检测ChTLRs(ChTLR1.1、ChTLR1.2、ChTLR2.1、ChTLR2.2、ChTLR4、ChTLR5和ChTLR15)信号传导分子MyD88、TRIF、TRAF6、NF-kB,炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α荧光定量方法,其敏感性佳、稳定性好、特异性强;(2)禽多杀性巴氏杆菌C48-1感染HD11细胞和雏鸡后发现ChTLR15的表达量在不同时间、不同组织中都显著上调,说明识别C48-1的Toll样受体为ChTLR15;(3)ChTLR15基因沉默后,发现ChTLR15识别C48-1后信号是经过MyD88依赖途径传递给TRAF6和NF-κB;同时还发现炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α)也受ChTLR15调控,说明ChTLR15介导炎症信号通路。(4)对MAPK家族和NF-κB蛋白进行Western blot检测,发现C48-1可以迅速激活MAPK信号通路中的ERK、P38、JNK蛋白,使其磷酸化,也能激活NF-κB,使其进入核内,说明NF-κB和MAPK参与了先天免疫应答。(5)NF-κB和MAPK信号级联被抑制后,发现TNF-α的释放与P38MAPK途径相关;IL-1β的释放与ERK途径有关;IL-6的释放P38MAPK、ERK和NF-κB途径有关;IL-12的释放与P38MAPK、ERK、JNK和NF-κB信号途径都有关。所以,本研究进一步丰富了禽类对禽源多杀性巴氏杆菌先天性免疫应答机制,为研制安全、高效的禽源多杀性巴氏杆菌新型疫苗提供理论依据。