背景:多溴联苯醚类物质(PBDEs)是一种溴化阻燃剂,属于溴代芳香族化合物。它作为环境内分泌干扰物以及持久性有机污染物,广泛存在于各种环境介质当中,自使用至今已经在全球范围内造成了严重污染。PBDEs具有生物蓄积作用,在动物体内血液、乳汁以及组织中均可以检测到它的存在,动物实验证实该类物质具有甲状腺毒性、神经毒性、生殖发育毒性以及内分泌干扰等作用。女性生殖健康一直是人们重点关注的问题,研究表明PBDEs可能导致女性流产、不孕甚至影响儿童生长发育,但是其对女性生殖健康损害的分子机制目前仍不明确。目的:本文欲使用对生物体毒作用最强的2,2’,4,4’-四溴联苯醚(PBDE-47)作为代表性多溴联苯醚类物质,利用人类胎盘滋养层细胞Be Wo细胞系模拟孕期母体胎盘组织,建立体外染毒模型,侧重于研究PBDEs对促黄体生成素、孕酮、雌二醇以及人类绒毛膜促性腺激素的影响,以及Be Wo细胞的一般细胞毒性、胆固醇转运相关基因及其表观的改变。方法:1.PBDE-47对Be Wo细胞增殖的影响:对细胞进行大范围染毒,应用MTS实验检测PBDE-47对Be Wo细胞增殖的影响,初步判断毒物的细胞毒性强弱,并通过该部分实验得到染毒时间以及染毒剂量,本研究最终选择毒物暴露剂量为0μM、0.1μM、1μM、10μM、50μM,处理时间为24h。2.PBDE-47对Be Wo细胞孕酮、雌二醇、促黄体生成素、人类绒毛膜促性腺激素的影响:PBDE-47染毒处理后,应用放射免疫方法检测细胞培养基中4种性激素含量,检测毒物对生殖相关激素的影响。3.PBDE-47对Be Wo细胞线粒体融合分裂以及膜胆固醇转运蛋白复合物相关基因m RNA水平的影响:细胞经PBDE-47染毒处理后提取RNA,经逆转录后进行实时荧光定量PCR,检测细胞线粒体融合分裂及线粒体膜胆固醇转运蛋白复合物相关基因m RNA水平。4.PBDE-47对Be Wo细胞线粒体融合分裂以及膜胆固醇转运蛋白复合物相关基因甲基化水平的影响:细胞经PBDE-47染毒处理后,经Sequenom飞行质谱检测细胞线粒体融合分裂及线粒体膜胆固醇转运蛋白复合物相关基因启动子位点甲基化水平的改变。结果:1.PBDE-47对Be Wo细胞增殖的影响:PBDE-47在12h染毒后,只有最高剂量组的毒物对细胞增殖影响较大,差异具有统计学意义,该剂量组细胞活性下降约20%;24h染毒后,PBDE-47可显著抑制细胞活性,从0.01μM~100μM剂量组,细胞活性下降具有统计学差异,呈递减趋势;经48h染毒后,Be Wo细胞增殖进一步下降,虽只有10μM~100μM剂量组数据具有统计学差异,但其下降趋势与24h染毒趋势相同,且最高剂量组100μM细胞活性下降明显超过24h染毒组。2.PBDE-47对Be Wo细胞孕酮、雌二醇、促黄体生成素、人类绒毛膜促性腺激素的影响:PBDE-47染毒24h后,Be Wo细胞分泌促黄体生成素水平随着染毒剂量的增高逐渐下降,在50μM组达到最低水平0.166IU,但无统计学意义;随着染毒剂量的增高,雌二醇释放量逐渐降低,呈递减趋势,与对照组(1776.65±59.44 pg/m L)相比10μM(1583±36.64 pg/m L)以及50μM(1497±21.55 pg/m L)染毒组,细胞的雌二醇分泌量显著下降(P<0.05),毒物与雌二醇的下降具有剂量反应关系;Be Wo细胞在接触PBDE-47后,孕酮的分泌水平有下调的趋势,与对照组(60.16±0.76 ng/m L)相比,10μM处理组(51.71±0.65 ng/m L)下降具有统计学差异;PBDE-47在24h染毒下,无论是低剂量或高剂量组,都不会对Be Wo细胞的人类绒毛膜促性腺激素造成明显改变。3.PBDE-47对Be Wo细胞线粒体融合分裂以及膜胆固醇转运蛋白复合物相关基因m RNA水平的影响:对于线粒体融合分裂相关基因,在PBDE-47染毒24h后,OPA1下降趋势不明显,但MFN1以及MFN2基因表达量具有明显的下降趋势,呈剂量反应关系,MFN1基因除10μM组,其他染毒组m RNA的降低均具有统计学差异,MFN2基因50μM染毒组m RNA表达量下降可达40%(P<0.05);PBDE-47对FIS1与OPA1基因的影响趋势相同,随染毒剂量的增加基因表达量逐渐升高,但只有DRP1基因50μM染毒组的高表达具有统计学差异。线粒体膜胆固醇转运蛋白复合物中,VDAC1与VDAC2随着PBDE-47染毒剂量的升高均没有明显的改变;ATAD3随着PBDE-47染毒剂量的增高,其m RNA表达量有下降趋势,0.1μM与50μM染毒组下降具有统计学差异;ACBD3基因在1μM与50μM剂量组表达明显上调;TSPO基因的改变与PBDE-47存在剂量反应关系,其m RNA的表达随着染毒剂量的增加逐步增加,50μM处理组相对于对照组而言,其高表达倍数可达1.64倍。4.PBDE-47对Be Wo细胞线粒体融合分裂以及膜胆固醇转运蛋白复合物相关基因甲基化水平的影响:Be Wo细胞在PBDE-47染毒24h后,FIS1基因第9位点以及第18、19位点在1μM剂量组甲基化水平显著上升,在50μM剂量组稍有下降,而18、19位点50μM处理组甲基化上升水平仍具有统计学差异。MFN1基因第23位点随着染毒剂量的增高甲基化水平逐渐上升,与对照组相比50μM剂量组具有显著的统计学差异。MFN2基因第19位点甲基化水平随染毒剂量增高逐渐下降。DRP1-2、DRP1-19以及OPA1-8在1μM剂量组甲基化水平降低至0%,50μM染毒时恢复至50%左右,其下降具有统计学差异。而VDAC2-2在1μM染毒时甲基化水平下降至2%,并具有统计学差异。ATAD3-16、17、18、19联合位点在1μM处理组中下降约达到20%,50μM处理组则无明显变化。结论:1.PBDE-47能够对Be Wo细胞的增殖产生影响,并具有剂量、时间效应关系,随染毒的浓度增加以及随着染毒的时间增加,细胞增殖逐渐下降。2.PBDE-47能够下调Be Wo细胞MFN1/2并上调DRP1的表达,破坏线粒体融合分裂功能;同时通过上调TSPO、ACBD3以及下调ATAD3来对Be Wo线粒体膜胆固醇转运蛋白复合物产生一定影响,降低了类固醇激素生成的速率。3.PBDE-47能够改变FIS1、MFN1、MFN2、DRP1、OPA1、VDAC2、ATAD3启动子区域特定位点的甲基化水平,通过表观遗传学修饰影响基因功能。