前列腺癌是欧美国家目前发病率居第二位的恶性肿瘤,随着人口平均寿命的延长以及生活水平的提高,我国前列腺癌的发病率正迅速上升,而早期诊断率低是导致失去治愈机会的关键原因。最常用的血清前列腺特异抗原(PSA)的检测、白细胞粘附抑制检测、直肠指诊、影像学(超声、CT、MRI)诊断结合针刺活检等方法均存在一定程度的误检和漏检率而不能适应临床诊断的需求。寻找新的生物标志物,建立有效的前列腺癌预警、早期诊断、转移复发预测方法是预防和改善前列腺癌愈后的难点。虽然疾病早期没有明显的临床症状,但当正常的前列腺组织发生癌变时,细胞会发生很多分子水平上的异常,如染色体的缺失或者增加,抑癌基因的低表达或者突变、基因启动子甲基化异常等等。基因水平的可测量性变化为早期诊断提供了可能。基于表观遗传调控在肿瘤发病中的理论研究基础,DNA甲基化正在成为一类充满希望的生物标志物。本课题拟通过检测与前列腺癌发病相关的基因的甲基化状态,分析启动子甲基化与前列腺癌的相关性,为利用甲基化标志物诊断前列腺癌的可行性奠定基础。分析甲基化的方法有多种,目前主要有MSP(Methylation Specific PCR)、RLGS(Restriction Landmark Genome Scanning)和DNA测序等技术,但这些技术或者存在实验要求高、或者缺乏客观性、可重复性不好等各种局限,难于推广应用。因此,研究新的、可定量、多点检测基因甲基化的分析方法具有重要意义。焦磷酸测序是继Sanger测序技术之后新一代的DNA测序技术,其测序过程中的实时定量的优势使焦磷酸测序技术在甲基化分析中正崭露头角。本课题首先以RARβ2为例建立焦磷酸测序技术分析基因启动子甲基化的方法,为进一步研究基因启动子甲基化标志物的检测奠定基础。本实验从正常人全血中提取基因组DNA。采用复合巢式PCR的方法扩增目的基因,克隆构建对照标准品质粒。使用甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子CpG岛的5个甲基化位点,双脱氧测序验证。将阳性和阴性对照标准品质粒PCR扩增产物按不同比例混合后进行焦磷酸测序,检测每个点的甲基化程度,制作校正曲线。构建RARβ2基因启动子甲基化区域对照标准品质粒,建立并优化PCR扩增条件。优化单链DNA模板的制备条件和焦磷酸测序分析的参数。分别对不同量的前列腺增生组织切片进行检测,并分析其甲基化程度的均一性。经焦磷酸测序检测后,阴性对照标准品甲基化程度达到0%,阳性对照标准品甲基化程度达到100%,与双脱氧测序结果一致。对混合样品检测后,发现甲基化频率符合线性关系,线性相关性大于0.99,斜率约为1,并且所有位点的标准偏差约为1%。在石蜡切片组织检测中RARβ2基因启动子甲基化程度基本一致。成功构建了甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2启动子区域甲基化阳性对照和阴性对照标准品质粒。建立了甲基化特异性焦磷酸测序检测石蜡切片组织样本基因启动子甲基化的方法。为分析相关基因甲基化与前列腺癌的关系,我们应用建立好的焦磷酸测序检测基因启动子甲基化检测方法对前列腺癌发病相关基因RARβ2、P16、CDH1、GSTP1启动子区域进行生物信息学分析,设计了焦磷酸测序引物,优化了PCR扩增条件。对40例前列腺增生(BPH)及前列腺癌病人的组织标本分别进行了RARβ2、P16、CDH1、GSTP1启动子区域甲基化水平分析。发现前列腺癌病人样本中至少有一个基因启动子被检测区域出现了高度甲基化。前列腺癌样本中RARβ2、CDH1基因启动子甲基化程度与前列腺增生样本相比较具有统计学差异。其他2个基因启动子甲基化程度癌症组略高于增生组但无统计学差异,说明P16、GSTP1所选启动子区域甲基化状态在前列腺癌与前列腺增生病人中差异不显著。本实验建立了焦磷酸测序检测基因甲基化的方法,分析了4个基因启动子甲基化与前列腺癌的关系,发现RARβ2、CDH1的异常甲基化与前列腺癌具有较高的相关性,为进一步甲基化标志物在前列腺癌的诊断和治疗研究奠定了基础。