论文部分内容阅读
植物地上部分覆盖着一层蜡质作为表皮的保护层,角质层蜡质决定的功能对于植物十分重要。蜡质具有防止紫外线辐射损伤,减少植物表面水分过度蒸发和抵抗病虫害侵入等功能,在植物对外界环境适应,减少生物和非生物胁迫方面起重要作用。一般来说,甘蓝型油菜和茎表皮均有蜡粉覆盖,而光叶突变体则表皮蜡减少或缺失,颜色亮绿有光泽。目前在芸薹属植物无蜡（光叶亮绿）性状的遗传规律方面有一定的研究,但该性状在不同材料之间存在着多样性。尽管在模式植物拟南芥中已经鉴定和克隆了很多蜡质合成转运及调控等相关基因,但是芸薹属作物的相关研究还非常少,关于甘蓝型油菜无蜡光叶性状定位方面的研究,目前尚未见报道。本研究是首次对一个显性光叶突变体进行表型描述和定位研究。光叶突变体GL展示出了表皮蜡质的急剧减少和表皮渗透性的增强,生化分析表明光叶突变体蜡质总量降低以及成分发生了改变。通过遗传分析和定位,将光叶基因BnaA.GL定位在A9连锁群末端,为了比较野生型和光叶突变体在表达水平上的差异,进行了cDNA芯片的比较分析,结果显示一组与脂肪酸合成及蜡质合成代谢相关的基因受到抑制,其表达量下降。这些信息为我们进一步精细定位和克隆该基因,探索蜡质调控的机理奠定了基础。主要研究结果如下：1.表皮形态学观察扫描电镜显示正常材料野生型WT和光叶突变体GL叶片及茎表皮蜡质差异很大,突变体表皮蜡质晶体明显减少,尤其是叶片。透射电镜显示,光叶突变体GL叶片和茎表皮层亲锇性弱,电子密度显著减少,但是比WT要厚。光叶突变体GL表皮蜡质减少和表皮结构的变化,导致其渗透性增加。TB测试显示光叶突变体叶表皮更容易被染色,叶绿素浸提速率和失水率均高于WT。2.遗传分析和基因定位野生型WT和突变体GL正反交F1都表现为光叶,在F2群体中,光叶与正常叶比例符合3：1,BC1群体中,光叶和正常叶比例符合1：1。遗传分析表明,光叶性状是受单个显性基因控制。基因初步定位显示,光叶性状为形态标记Y被定位于N9连锁群末端。在此基础上,BSA法结合AFLP技术,以及联合多种方式开发SSR标记、IP标记,搜索该区段已经公布信息以及利用SNP芯片结合BSA法等,最终在一个BC3F2的1200单株的群体中,通过标记分析,将光叶基因BnaA.GL定位到A9连锁群末端,开发的分子标记距离目标基因0.67-1.33cM,遗憾的是标记均位于目标基因一侧。根据网站提供的白菜序列信息比对分析（http://brassicadb.org/brad/）,与目标基因最近的分子标记距离白菜R9连锁群末端最后一个注释基因的距离250kb。该区段包括有白菜46个注释基因,与拟南芥基因组同源线性比对分析显示,共线性较好,对应拟南芥AT1G01190到AT1G02205区段。候选区段的最后一个白菜基因Bra032670是AT1G02205（CER1）的同源基因。CER1是与蜡质合成有关的酶,其T-DNA插入突变体表型是光杆不育的。因此我们认为该基因为可能的候选基因。3.叶脂质分析和蜡质分析通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）的分析方法,对WT,突变体GL, DH系中的正常系DH line2和光叶系DH line7四个样本进行了脂质分析和蜡质分析。结果表明,突变体GL和光叶系DH line7显示出脂肪酸C16：0和C18：3的增加,而缺乏C22：0。超长链脂肪酸（VLCFAs）,总含量显著减少。蜡质分析中,薄板层析（TLC）分析结果显示,突变体GL和光叶系DH line7萌发后四周叶片提取的蜡质中缺乏烷烃,酮以及二级醇,而醛大量积累。GC-MS分析表明,突变体GL和光叶系DH line7显示除醛增加以外,蜡酯,初级醇和脂肪酸略有减少,而蜡质总含量显著降低。4. cDNA芯片分析由于定位方面进展缓慢,因此采用cDNA芯片分析的方法,试图进行差异表达基因分析,为定位提供一定指导,同时初步分析蜡质合成代谢途径的网络,解析蜡质合成受阻的原因。以WT,突变体GL, DH系中的正常系混合成的正常RNA池DHNB和l光叶系混合成的光叶RNA池DHGB四个RNA为样本,利用加拿大PBI研发的甘蓝型油菜90KcDNA芯片进行了芯片分析。芯片结果显示,差异表达基因可以被分成很多的大类,包括：光合作用和碳代谢、脂和蜡质代谢、DNA的转录调控、生物和非生物逆境响应等,此外,还包括与与转录相关、发育相关以及未知的功能等类别。在分析了脂肪酸代谢和蜡质代谢途径差异表达基因之后,发现在光叶材料中脂肪酸从头合成到蜡质合成整个代谢途径在光叶材料中都受到抑制,尤其是脱羰基途径中的CER1基因,下降倍数最多。藉此,对挑选出来与脂代谢等相关代谢途径的部分基因进行了Real-Time PCR验证,证实其中大部分基因表达情况与芯片结果一致。根据验证结果,初步绘制了蜡质代谢途径的简图。5.候选基因分析CER1被认为可能是脱羰基途径上编码催化醛脱羰反应的酶,拟南芥突变体cerl-1具有光杆表型,生化特征与甘蓝型油菜光叶突变体GL相似,芯片分析及Real-Time PCR验证了该基因严重受到抑制,且该基因的同源基因位于候选区段,因此将其作为候选基因,进行序列分析和基因转化实验。序列分析表明,在甘蓝型油菜WT的cDNA中扩增出4种CDS拷贝,但在光叶突变体cDNA中未能扩增出CDS序列。在甘蓝型油菜WT的DNA中除扩增出含有内含子的拷贝外还扩增出不带有内含子的拷贝,可能为假基因。通过TAIL技术得到了启动子序列。经过比较测序,仅发现一个在WT和GL有差异的拷贝,且SNP差异位点位于内含子。从光叶突变体基因组DNA中分离出这个含有SNP差异位点的拷贝,并构建了遗传转化载体,但遗憾的是没有得到预期的表型。构建了过表达载体,所用启动子分别为CaMV35s启动子和油菜自身的启动子。两种载体在花絮浸染法转化拟南芥cerl-1突变体（SALK008544C）时,未能获得阳性植株。在转化野生型拟南芥时,BnCER1在CaMV35s启动子驱动下的载体转化后没有得到表型,而BnCER1在自身启动子驱动下的载体转化后得到的转化阳性植株展示出了光杆不育的表型。经扫描电镜观察,其茎表皮蜡质急剧减少,花粉形态不正常。通过分析转基因植株与WT外源及内源CER1基因表达水平,初步推断可能是发生了共抑制现象。6.甘蓝型油菜正常蜡质WT和光叶突变体GL抗逆性差异用WT和和光叶突变体GL进行抗旱抗逆相关实验。通过设置包括对照,干旱处理,盐处理以及ABA处理三种处理。与对照相比,在不同处理下,蜡质积累均有增加,失水率,叶绿素浸提率和相对含水率均有下降,但变化幅度不同。与蜡质合成相关基因BnCER1在WT盐处理之后,基因表达量上升,在干旱和ABA处理之后均下降。