低氧诱导因子HIF3α在神经管畸形中的表达及作用分析

来源 :山西医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:jy02132679
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目的:探讨低氧诱导因子在神经管畸形中的作用及其可能的机制。首先使用维甲酸建立神经管畸形(NTDs)动物模型,取NTDs胚胎脑组织进行转录组测序,经过生物信息学分析后得到低氧诱导因子HIF3α与基因BNIP3表达发生变化,所以将其作为本次实验的主要研究靶点。其次,通过使用维甲酸体外干预PC12细胞,在细胞水平探讨靶基因HIF3a与BNIP3以及细胞凋亡之间的相互关系,进而揭示其在神经管畸形发生发展过程中的作用和可能的机制。方法:1.在C57BL/6J小鼠怀孕7.5天(E7.5)时通过灌胃将一定量的维甲酸注入小鼠体内,造成胚胎神经管畸形(NTDs)的模型;造模成功后取E10.5天胚胎脑组织进行转录组测序并分析测序结果,发现在神经管畸形的形成过程中低氧诱导因子HIF1a、HIF3a及相关下游基因BNIP3的表达发生了改变。2.通过实时定量聚合酶链反应Real-time PCR检测胚胎脑组织中HIF1a、HIF3a、BNIP3 mRN A表达情况,即对测序结果进行了验证。3.在细胞水平进一步验证,通过使用不同浓度维甲酸(0μM、20μM、40μM)在体外对PC12细胞干预培养,采用Real-time PCR和Western blotting检测靶基因在细胞中的表达变化;4.为研究靶基因变化与细胞凋亡的关系,使用流式细胞仪分别检测不同浓度维甲酸干预后细胞的凋亡情况、产生活性氧的变化以及细胞线粒体膜电位的变化情况;5.为进一步研究HIF3a和BNIP3以及细胞凋亡机制之间的相互关系,通过使用脂质体将化学合成的siRNA转染进PC12细胞干扰HIF3α的表达,抑制了HIF3α表达后,将细胞分为四组,即正常对照组、维甲酸干预组,HIF3αsiRNA细胞转染组和hif3αsirna细胞转染后再加维甲酸干预组,采用real-timepcr和westernblotting检测分析bnip3的表达变化;6.使用流式细胞仪分别检测四组细胞的凋亡情况;7.对四组细胞进行活化的caspase3染色,在荧光显微镜下观察各组caspase3的激活情况。结果:1.使用21mg/kg剂量的维甲酸,小鼠胚胎神经管畸形造模成功,对照组胚胎整体形态完整,轮廓、体节清晰,体积较大,脑部充盈饱满,畸形组胚胎体积较小,体节不明显,常有脑部发育不足或脑膨出,测序分析得到畸形组低氧诱导因子hif1a表达下降,差异无统计学意义,hif3a、bnip3表达升高,差异有统计学意义;2.real-timepcr检测结果与测序结果一致,畸形组低氧诱导因子hif1α表达下降,差异无统计学意义,hif3α、bnip3表达升高,差异有统计学意义,推测hif3a、bnip3可能与ntds的有关;3.在细胞水平上,通过real-timepcr和westernblotting的结果分析得到,细胞中hif3α、bnip3随着使用维甲酸剂量的加大表达升高,与体内组织中的实验结果一致。4.流式的细胞分析结果显示,使用维甲酸的剂量越大,细胞凋亡越多,产生的活性氧越多,细胞线粒体膜电位越低,表明维甲酸可能是通过上调靶基因表达诱导细胞凋亡。5.通过脂质体转染sirna进pc12细胞,转染效率一般为70%左右,干扰hif3α的表达抑制了bnip3的表达以及维甲酸诱导的bnip3表达的升高;6.流式结果显示,干扰hif3α的表达抑制了维甲酸诱导的细胞凋亡,由此说明,维甲酸诱导的细胞凋亡是通过hif3α调控bnip3实现的。7.维甲酸能够激活caspase3,干扰hif3α能在一定程度上抑制对caspase3的活化。结论:维甲酸诱导HIF3α、BNIP3表达升高并激活caspase3,HIF3α通过调控BNIP3的表达从而影响细胞凋亡。
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