硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate,CS）是一类酸性糖胺聚糖类大分子粘性多糖,在治疗风湿病、骨质疏松症、关节炎、腰间盘突出等方面具有重要作用。在硫酸软骨素生产、优化过程中需要对软骨素含量进行及时检测。本论文研究偶联了专一性的酶解法与蒽酮-硫酸法,快速测定了复杂培养液中的软骨素含量。该方法通过超滤去除单糖等小分子杂质后,将多糖用专一性硫酸软骨素裂解酶分解为寡糖,再通过超滤去除大分子杂质,得到的寡糖过滤液使用蒽酮-硫酸法快速测定了糖含量。此多糖定量方法可以选择不同特异性的裂解酶,适用于复杂培养液中其他多糖的快速定量。本研究建立了发酵液中软骨素类多糖含量的定量检测方法。首先,成功表达、纯化了硫酸软骨素裂解酶As Chn AC,Brandford法对纯化的硫酸软骨素裂解酶As Chn AC进行定量,终浓度为2 mg/m L。通过~1H NMR检测证明NMR法不能用于测定复杂培养基中的硫酸软骨素C含量。质谱分析As Chn AC酶解后的产物,显示酶解后二糖的m/z值为457.7,480.1,即高分子硫酸软骨素被酶切成了二糖。且在酶解960 min后,酶解率可达96.5%。通过使用截留分子量为10 k Da的超滤管先将培养液中的小分子干扰物去除。然后,用硫酸软骨素裂解酶As Chn AC将硫酸软骨素类多糖降解为不饱和寡糖,再次通过超滤,去除不可酶解的高分子成分,收集寡糖。使用蒽酮-硫酸法测定寡糖含量,对软骨素的浓度进行定量。最后,本研究通过Red同源重组系统,对大肠杆菌K4的果糖基转移酶基因kfo E进行敲除,得到K4△kfo E菌株。其产物去除了该菌荚膜多糖中的果糖基团,合成了软骨素,是制备硫酸软骨素的重要原材料。通过上述建立的化学酶法测定出K4△kfo E上清中软骨素浓度为31.5 mg/L。本研究提供了一种发酵液中软骨素类多糖含量的定量检测方法,可以快速地测定复杂培养液中的软骨素类多糖含量。该方法具有普适性,利用不同专一性的多糖裂解酶,该方法也可以扩展使用于其他多糖的定量分析。