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烟草是世界上最广泛种植的商业性非食物叶用经济作物,烟草的品质与其经济价值直接相关。油脂是烟草品质的重要指标,含油脂多的烟叶色泽鲜亮纯净,组织细致柔软,弹性强,在含水较低的情况下,仍能保持油润状态,有较大韧性,烟叶经贮存不宜褪色。另外,植物脂肪酸组成还与抗逆性有关。目前植物中的脂肪酸代谢途径很清楚,但是烟草S4D基因与品质、抗逆性之间的关系研究还未见相关报道。本实验首次克隆了烟草NtSAD1基因,初步分析了其生物学功能。主要研究如下:1.NtSAD基因在烟草根、茎、叶中均有表达,在叶中的表达高于根和茎,其中NtSAD1在旺长期叶中的表达量最大。在伸根期,茎、叶中NtSAD1表达量是根中的1.89倍、19.97倍。在旺长期,茎、叶中NtSAD1的表达量分别为根中的2.81倍、17.02倍;在成熟期,茎、叶中NtSAD1基因的表达量分别为根中的1.53倍、9.71倍。在紫光、蓝光、黄光和红光处理下,NtSAD1的表达量均上升,这表明该基因的表达与光照有密切关系;而在干旱、SA、乙烯、ABA处理下,NtSAD1表达量下降,这表明NtSAD1响应这些非生物胁迫,以此来调节烟草中的脂肪酸比例。在机械损伤情况下,NtSAD家族中只有NtSAD1基因的表达量是上升的,推测可能是一种应激反应。2.从烟草K326中克隆了NtSAD1基因并分析其cDNA序列特征。该基因包含3个外显子和2个内含子序列,其中第一个内含子最大。NtSAD1基因编码蛋白包含大约400个氨基酸,相对分子质量约为45.2kDa,等电点为6.29。由18种氨基酸构成此蛋白,Leu的含量最丰富(大约占8.9%),有个55带负电荷氨基酸(Asp+GLu)和51个带正电氨基酸(Arg+Lys)。NtSAD1的67-389氨基酸序列是酰基-ACP脱饱和酶家族的保守序列。二级结构分析显示,SAD蛋白含有186个α-螺旋,占47.09%;46个β-折叠,占14.18%;37个β-转角,占9.37%;116个自由卷曲,占29.37%。亚细胞定位预测分析显示,其主要存在于叶绿体基质中,该蛋白没有跨膜结构。3.为了探讨NtSAD1的生物学功能,构建了 pCAMBIA1300表达载体和CRISPR沉默表达载体,为烟草育种提供了新的材料。初步研究表明,NtSAD1基因过表达后,使得饱和脂肪酸的含量减少,而不饱和脂肪酸的含量增加。NtSAD1过表达烟株中SOD酶活性、POD酶活性、脯氨酸含量均高于对照中的含量,NtSAD1沉默烟株中SOD酶活性、POD酶活性、脯氨酸含量均低于对照中的含量,说明NtSAD1基因和植物的抗逆性密切相关。