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背景:乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤,其中Luminal B(HER2~+)型乳腺癌常表现为局部复发早、淋巴结转移频繁、内分泌治疗耐受且预后差,对患者生存率影响极大。目前乳腺癌诊断以影像学方法为主,但对一些微病灶仅通过影像诊断可能难以确定病变性质,存在假阳性、假阴性等情况。因此,亟待开发出高特异性肿瘤标记物分子探针,用于乳腺癌的早期诊断和靶向药物递送。由于核酸适配体是一类亲和力高、特异性强、稳定性好的分子探针,在肿瘤早期诊断和治疗方面具有广泛的应用前景。因此,本文以Luminal B(HER2~+)型乳腺癌细胞株ZR-75-1为靶标,人正常乳腺上皮细胞株Hs578Bst为对照,应用Cell-SELEX技术筛选与靶细胞特异性结合的核酸适配体。方法:为了扩增出特异性ssDNA,首先对对称PCR和不对称PCR反应条件进行优化。将培养至对数生长期的ZR-75-1和Hs578Bst细胞分别作为正筛细胞和反筛细胞,进行Cell-SELEX筛选。利用5’端带有FAM的引物进行不对称PCR扩增,使用流式细胞术监测特异性核酸序列的富集情况。将最后一轮筛选到的ssDNA文库进行克隆并测序。从测序结果挑选出10条富集程度较高的序列,使用NUPACK在线分析软件进行二级结构的预测和分析。挑选3条二级结构自由能较低的序列进行化学合成,并在5’端连接FAM荧光基团。通过流式细胞术对核酸适配体亲和力进行测定。使用荧光显微镜观察核酸适配体与靶细胞结合情况。结果:1.PCR优化条件:不对称PCR体系中下游引物占整个体系的比例为4/1000时不对称PCR结果较好,PCR反应的最佳退火温度为60℃。2.通过20轮Cell-SELEX循环,成功筛选到一组与ZR-75-1细胞特异性结合的ssDNA序列。3.流式细胞术分析显示,核酸适配体ZR5与靶细胞ZR-75-1的结合能力最强,平衡解离常数为59.17±4.37 nM。而核酸适配体ZR6和ZR7与靶细胞的结合能力相对较弱。4.荧光显微镜成像结果也证实ZR5与靶细胞ZR-75-1具有较强的结合能力,且不与正常乳腺上皮细胞Hs578Bst结合。结论:本实验利用Cell-SELEX技术成功筛选出能与乳腺癌细胞ZR-75-1特异性、高亲和力结合的核酸适配体ZR5,为Luminal B(HER2~+)型乳腺癌肿瘤标记物发现、早期诊断和靶向递送药物工具发展奠定了实验基础。