论文部分内容阅读
飞蝗是我国的重大农业害虫,其引发的蝗灾对农业生产造成很大的威胁。目前最主要的防治方法仍是化学防治。化学农药的施用使飞蝗产生了一定程度的抗药性,细胞色素P450是昆虫体内的一类解毒酶系,目前认为与抗药性相关的P450基因多集中于CYP4、CYP6和CYP9家族中。本文以飞蝗为研究对象,经分离克隆获得三个细胞色素P450基因,进而系统地研究了其分子特性和对杀虫剂的解毒功能,为飞蝗的有效防治和抗药性研究提供了理论依据。本文主要研究内容如下：一、飞蝗三个细胞色素P450基因的克隆和序列分析基于飞蝗表达序列标签(ESTs)和转录组数据库,采用生物信息学方法搜索得到细胞色素P450基因序列,经Blast分析,选取CYP4、CYP6和CYP9家族各一条序列进行了深入研究。通过生物信息学比对方法发现,CYP6和CYP9家族基因cDNA序列已经具备了全长序列的基本保守区,而CYP4家族序列为部分片段,需要进一步获取全长序列。采用RACE-PCR技术进行扩增,从而获得CYP4家族基因的5’端序列。进一步对三个细胞色素P450基因的全长cDNA序列进行验证,验证后的全长序列提交国际细胞色素P450命名委员会,分别将其命名为CYP4G62、CYP6EL1和CYP9AQ1。与果蝇中CYP4、CYP6和CYP9家族全部基因进行聚类分析,结果表明：CYP4G62全长1992bp,包含1662bp开放阅读框,66bp5’和264bp3’非编码区：CYP6EL1全长2103bp,其中1503bp为开放阅读框,84bp5’和489bp3’非编码区：CYP9AQ1全长2103bp,包含1578bp开放阅读框,57bp5’和935bp3’非编码区。三个P450基因的分子量分别为63.5、58.0和60.4kDa。等电点分别为6.80、6.84和7.20。二、飞蝗三个P450基因的mRNA表达模式采用Real-time PCR技术检测了细胞色索P450基因在飞蝗不同组织部位的表达。结果显示：(‘YP4G62主要在肌肉别脂肪体中表达,(’YP6EL1主要在中肠、胃盲囊和脂肪体中表达,(‘YP9AQ1主要在脑和脂肪体中表达。进一步检测飞蝗不同发育阶段细胞色素P450基因的表达,结果表明：CYP4G62和CYP9AQ1在若虫期的表达量最高,且随着龄期的增加呈增加的趋势,在五龄若虫时表达量最高,成虫期表达量急剧下降；CYP6EL1在卵中表达量最高,其它各龄期表达量均较低。选取不同浓度的农药点滴处理飞蝗,发现马拉硫磷可以不同程度地诱导三个细胞色素P450基因的表达,而西维因对三个细胞色素P450基因的表达没有影响。三、飞蝗三个P450基因的生物学功能研究为了进一步研究飞蝗三个细胞色素P450基因的生物学功能,采用RNA干扰(RNAi)技术,将体外合成的双链dsRNA注入飞蝗体内,进一步点滴农药,研究其对农药的敏感性。结果显示：飞蝗体内注入dsCYP6EL1和dsCYP9AQ1后点滴毒死蜱,与对照相比,其死亡率分别增加了29.35%和17.35%；点滴西维因后,死亡率分别增加19.94%和31.04%。飞蝗体内注射dsCYP4G62、dsCYP6EL1和dsCYP9AQ1后分别点滴溴氰菊酯,其死亡率分别增加26.88%、33.78%和20.53%。表明CYP4G62、CYP6EL1和CYP9AQ1对溴氰菊酯具有一定的解毒作用,同时CYP6EL1和CYPgAQl对毒死蜱和西维因有解毒作用,但三个细胞色素P450基因对马拉硫磷和DDT均无解毒功能。本文以飞蝗为研究材料,通过克隆获得三个细胞色素P450基因的全长；检测了三个基因在飞蝗体内不同组织部位、不同发育龄期和不同农药诱导后基因的表达模式,阐明了三个细胞色素P450基因对常用杀虫剂代谢解毒的贡献。本文研究结果不仅从理论上阐述了三个细胞色素P450基因的分子特性及在杀虫剂代谢解毒中的功能作用,也为飞蝗防治工作中合理使用农药提供了一定的借鉴意义。