[背景]中医体质是指人体生命过程中,在先天禀赋和后天获得的基础上所形成的形态结构、生理功能和心理状态方面综合的、相对稳定的固有特质。体质决定着病证种类的倾向性,同时又是决定病性、病位、病程阶段和病变趋势的重要因素。阳虚体质是指由于阳气不足,失于温煦,以畏寒怕冷,手足不温,喜热饮食,精神不振等虚寒表现为主要特征的体质状态。由于阳气能卫护肌表,防御外邪之入侵,具有气化、温煦的功能,阳气不足则易患感冒、痰饮、水肿、痹证、泄泻等证。近年来,本课题组前期流行病学调查发现:①随着健康向亚健康、疾病的转化,中医偏颇体质的比例逐渐增大;②健康和亚健康人群中阳虚体质比例不小,位于偏颇体质中的前三位。可见,阳虚体质与健康状态密切相关。因此,很有必要对阳虚体质进行干预,对于及早调整体质的偏颇状态,预防疾病的发生有着重要的意义。目前中医体质的机制研究多侧重于基因多态性、基因差异表达等方面。然而中医体质是由先天遗传因素与后天环境因素综合作用而形成的,基因的差异并不能完全阐明中医体质的分子机制。代谢组学是继基因组学、蛋白质组学后系统生物学的另一重要研究领域,它利用高通量、高效率、高灵敏度的现代分析手段,对代谢循环中的小分子代谢物(一般是指相对分子质量小于1000的低分子化合物)的整体组成,进行动态跟踪分析,借助多元统计分析方法,能够即时、灵敏的反映基因、环境等内外因素所引起的生物体功能状态的改变,为临床提供客观的信息。体质现象即是体内阴阳、气血、津液盛衰变化的反映状态,具有相同体质现象应有着共同的物质基础,这种生命活动的物质基础应当反映在基因、蛋白、细胞、组织脏器乃至整体等各个层次上,而代谢产物处于生命调控的末端。代谢组学与其他组学相比更接近表型,反映的是已经发生了的生物学事件,亦是基因型与环境共同作用的综合结果。因此,代谢组学研究有助于对体质进行客观分类并发现不同体质类型的生物标志物,为“体质可分”理论提供科学依据,将对于揭示中医体质现象带来更加全面的认识。体质既具有一定的稳定性又具有动态可变性,可通过干预调整其偏颇。体质调理方法包括健康宣教、饮食调养、运动调养、情志调养、起居调养等生活方式干预和药物干预方法。中医方药具有整体、双向调节的特点,是干预体质的重要手段。桂附地黄丸源自《金匮要略》肾气丸,由肉桂、附子(制)、熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻八味药组成。方中泽泻、茯苓利水渗湿,牡丹皮清泻肝火,熟地黄味甘、性温,养血滋阴、补精益髓,山茱萸补肝肾之阴,山药滋补脾阴,肉桂味辛、甘,性大热,补火助阳、益阳消阴,配附子温散之力较强。全方配伍意在补中寓泻,以使补而不腻,达到“阴中求阳”。桂附地黄丸具有温补肾阳的功效,是调理阳虚体质的常用方剂,但其药理机制尚未完全阐明。综上所述,本研究拟纳入健康和亚健康人群阳虚体质,以排除疾病对体质的影响,将阳虚体质随机分成两组,对照组给予生活方式指导,试验组在生活方式指导的基础上给予桂附地黄丸干预,评价研究对象的健康促进生活方式量表评分、中医体质量表评分和自测健康量表评分;对平和体质、阳虚体质的血浆利用核磁共振(NMR)技术方法进行代谢组学分析,找到阳虚体质潜在的分子标志物;对阳虚体质干预前后血浆进行代谢组学分析,从代谢组学角度阐明桂附地黄丸干预阳虚体质的疗效机制,为中医药手段干预阳虚体质提供科学依据。[目的]1、以健康和亚健康人群阳虚体质为切入点,明确桂附地黄丸干预阳虚体质的临床疗效。2、从代谢组学角度阐明桂附地黄丸干预阳虚体质的疗效机制,为中医药手段干预阳虚体质提供科学依据。[方法]1、进行阳虚体质中药干预的临床观察研究。通过填写本课题组研制的自测健康量表和常规体检结果进行健康判断,根据《中医体质分类与判定表》进行中医体质辨识,按照患者知情同意原则,共纳入研究对象62例,并将其随机分为对照组(31例)和试验组(31例)。对照组给予健康促进生活方式指导,包括自我实现、健康责任、运动和锻炼、营养、人际关系和压力管理方面。试验组在生活方式指导的基础上给予桂附地黄丸,连续服用28天。两组干预后1个月、6个月、12个月各随访1次。采用健康促进生活方式量表评估两组生活方式水平,采用中医体质量表评价体质干预疗效,采用自测健康量表评价健康状态,实验室相关检查评价药物安全性。应用Epidata 3.0软件双人独立录入建立数据库。统计分析采用SPSS13.0统计软件进行,结果表示为:均数±标准差(X±S)。所有统计推断均采用双侧检验,具有统计学意义的检验水准α=0.05,参数的可信区间估计采用95%的可信区间。计数资料用PearsonX2检验;两样本计量资料比较用两独立样本t检验。重复测量数据用重复测量方差分析,满足球形检验者,采用Sphericity Assumed法分析;不满足球形检验者,采用Greenhouse-Geisser法分析。重复测量方差分析多重比较比较采用Least Significant Difference(LSD)法分析。P<0.05表示有统计学意义。2、进行平和体质与阳虚体质比较的代谢组学研究。从纳入观察的阳虚体质人群中对照组选择10例,试验组选择10例。并纳入平和体质10例。试验开始前1天抽血,清晨空腹,血液收集于肝素钠溶液抗凝预处理后的离心管中,混匀,4℃,1000×g离心10min,吸取上层血浆,置-80℃冰箱保存。采用1H-NMR检测方法,进行代谢组学分析。3、进行生活方式干预阳虚体质的代谢组学研究。纳入阳虚体质对照组10人,对生活方式干预前后血浆进行代谢组学分析。试验开始前1天和干预1个月后抽血,清晨空腹,血液收集于肝素钠溶液抗凝预处理后的离心管中,混匀,4℃,1000×g离心1Omin,吸取上层血浆,置-80℃冰箱保存。采用1H-NMR检测方法,进行代谢组学分析。4、进行桂附地黄丸干预阳虚体质的代谢组学研究。纳入阳虚体质试验组10人,对桂附地黄丸干预前后血浆进行代谢组学分析。试验开始前1天和干预1个月后抽血,清晨空腹,血液收集于肝素钠溶液抗凝预处理后的离心管中,混匀,4℃,1000×g离心1Omin,吸取上层血浆,置-80℃冰箱保存。采用1H-NMR检测方法,进行代谢组学分析。5、汇总代谢组学数据进行分析,采用MestReNova5.3软件进行代谢图谱预处理,对各分段积分值进行归一化处理,所得数据输出并转换到Excel格式。将Excel格式数据导入软件Simca-P 12.0.1.0(UmetricsAB,Sweden)中进行多元统计分析。数据采用平均中心化(mean centering)或Pareto标度化(Pareto scaling)进行预处理后,采用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal Partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)进行分析。在 OPLS-DA 模型中提取 VIP值(variable importance in projection,VIP),选取VIP值>1的化学位移值,进一步对这些化学位移值的归一化积分(X±S表示)进行统计学分析(阳虚体质与平和体质积分比较采用两独立样本t检验;生活方式干预前后积分比较采用配对t检验;桂附地黄丸干预前后积分比较采用配对t检验),统计检验水准为α=0.05。提取P<0.05的化学位移值进行差异代谢产物成分鉴定。通过人类代谢产物数据库(http://www.hmdb.ca)及查阅文献来鉴定相关代谢产物的名称。结果:1、桂附地黄丸干预阳虚体质的临床观察研究对照组1例干预后12个月失访,试验组1例干预后1个月因去外地实习退出。其余所有入组对象均完成临床试验及随访。对照组和试验组年龄、性别比、BMI差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。两组样本具有均衡性,对照组和试验组具有可比性。1.1健康促进生活方式量表评分重复测量方差分析结果显示,健康促进生活方式量表各维度评分及健康促进生活方式总分对照组和试验组组间差异无显著性(P>0.05)。干预后1个月、6个月,试验组自我实现评分与干预前相比显著上升,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后12个月,对照组运动和锻炼评分较干预前显著上升,差异有统计学意义(P=0.028)。干预后1个月、12个月,试验组运动和锻炼评分与干预前相比显著上升,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后1个月、6个月、12个月,对照组和试验组营养评分均较干预前显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后1个月、6个月、12个月,试验组压力管理均较干预前显著改善,差异有统计学意义(P<0.05)。健康促进生活方式总分对照组和试验组不同时间点差异有统计学意义(F=5.595,P=0.002;F=8.605,P=0.000)。干预后1个月、6个月、12个月,对照组和试验组健康促进生活方式总分与干预前相比均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。1.2桂附地黄丸干预阳虚体质对体质评分的影响1.2.1阳虚体质转化分经重复测量方差分析,结果显示组间差异有显著性(F=6.123,P=0.016),不同时间点差异有显著性(F=14.642,P=0.000),分组和时间之间有交互效应(F=3.545,P=0.016)。对照组不同时间点差异有统计学意义(F=5.207,P=0.002)。干预后12个月对照组阳虚体质转化分与干预前相比显著下降,差异有统计学意义(P=0.037)。试验组干预后各时间点阳虚体质转化分呈下降趋势,不同时间点差异有统计学意义(F=14.185,P=0.000)。与干预前相比,试验组干预后]个月、6个月、12个月阳虚体质转化分均显著下降(P<0.05)。进一步分析各时间点两组的阳虚体质转化分差异,结果显示干预前,对照组和试验组阳虚体质转化分比较,差异无统计学意义(F=0.005,P=0.941);干预1个月后,与对照组相比,试验组阳虚体质转化分数显著下降,差异有统计学意义(F=8.513,P=0.005);干预后6个月、12个月,与对照组相比,试验组阳虚体质转化分数仍有所下降,差异有统计学意义(F=4.163,P=0.046;F=5.003,P=0.029)。1.2.2阳虚体质量表各条目原始分干预1个月后,与对照组相比,试验组在手脚发凉、冬天更怕冷夏天不喜吹空调这两条症状方面显著改善,差异有统计学意义(t=3.145,P=0.003;t=2.850,P=0.006)。干预后6个月,与对照组相比,试验组胃脘、背、腰膝怕冷的症状有所改善,差异有统计学意义(t=2.060,P=0.044)。干预后12个月,与对照组相比,试验组冬天更怕冷夏天不喜吹空调的症状显著改善,差异有统计意义(t=2.309,P=0.024)。1.2.3其他体质转化分重复测量方差分析结果显示平和体质转化分试验组组内不同时间点比较差异有统计学意义(F=2.820,P=0.043)。试验组干预后6个月,平和体质转化分较干预前显著上升,差异有统计学意义(P=0.016);湿热体质转化分较干预前显著下降,差异有统计学意义(P=0.027)。进一步分析各时间点两组的各体质转化分差异,干预前对照组和试验组各体质转化分之间无统计学差异(P>0.05)。干预后6个月,与对照组比较,试验组气虚质转化分下降,差异有显著性(F=4.290,P=0.043)。1.3桂附地黄丸干预阳虚体质对健康状态的影响1.3.1健康和亚健康比例分布比较根据自测健康量表和常规体检结果进行健康判断,纳入健康和亚健康人群阳虚体质62例。对照组31例,其中健康16例,亚健康15例;试验组31例,其中健康14例,亚健康17例。两组干预前健康和亚健康比例分布差异无统计学意义(P=0.611)。干预后1个月、6个月、12个月,对照组和试验组健康和亚健康比例差异无显著性(P>0.05)。1.3.2自测健康评分及各子量表评分自测健康量表包含生理、心理、社会三个子量表。重复测量方差分析结果显示,生理健康转化分、心理健康转化分、社会健康转化分和自测健康评分转化分组间差异均无显著性(P>0.05),不同时间点差异均无显著性(P>0.05)。进一步比较对照组和试验组干预后1个月、6个月、12个月,生理健康转化分、心理健康转化分、社会健康转化分、自测健康评分转化分均有上升趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05)。对各时间点两组生理健康转化分、心理健康转化分、社会健康转化分、自测健康评分转化分比较,组间差异均无统计学意义(P>0.05)。1.3.3 生理健康各维度评分生理健康子量表包含身体症状、器官功能、身体运动功能、精力4个维度。重复测量方差分析结果显示,各维度评分对照组和试验组组间差异无显著性(P>0.05)。干预1个月后,试验组器官功能评分较干预前显著上升,差异有统计学意义(P=0.031);干预后12个月,对照组器官功能评分较干预前显著提高,差异有统计学意义(P=0.038)。对照组和试验组干预后各时间点身体症状、身体运动功能、精力与干预前相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。1.3.4 心理健康各维度评分心理健康子量表包含正向情绪、心理症状、认知功能3个维度。重复测量方差分析结果显示,各维度评分对照组和试验组组间差异无显著性(P>0.05)。干预后12个月,对照组认知功能评分较干预前显著上升,差异有统计学意义(P=0.006)。对照组和试验组正向情绪、心理症状评分干预后各时间点与干预前相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。1.3.5 社会健康各维度评分社会健康子量表包含社会适应、社会资源、社会支持3个维度。重复测量方差分析结果显示,社会资源评分组问差异无显著性(F=0.437,P=0.511),不同时间点差异无显著性(F=0.173,P=0.162)。干预后6个月,试验组社会适应评分较干预前显著上升,差异有统计学意义(P=0.027)。干预后12个月,试验组社会支持评分较干预前显著升高,差异有统计学意义(P=0.024);与对照组相比,差异有显著性(P=0.036)。1.4 安全性评价指标对照组和试验组干预前血常规、尿常规、肝肾功能、血脂、心电图、胸片均未见异常,两组干预前安全性指标比较差异无显著性(P>0.05)。干预1个月后,试验组各项指标均未见异常,与对照组相比,差异无显著性(P>0.05)。随访期间,试验组全部研究对象未出现药物不良反应。2、阳虚体质与平和体质的血浆代谢组研究采用PCA方法对阳虚体质(n=20)与平和体质(n=10)样本建模,累计计算出9个主成分,模型参数R2X=0.966,Q2=0.743,模型分析了 96.6%的原始数据,累计贡献率为74.3%。两组之间有分离趋势,但存在部分交叉重叠,没有完全区分开。对两组样本进一步建立OPLS-DA模型,最终计算出5个主成分,模型参数R2X=0.812,R2Y=0.714,Q2=0.452。将VIP值>1的变量的归一化积分值进行统计学分析,发现阳虚体质组与平和体质组血浆中潜在的差异代谢物有11个。与平和体质相比,阳虚体质血浆中乳酸、丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、3-羟基丁酸、α-葡萄糖6种物质含量下降,氧化三甲胺、胆碱、甘氨酸、肌醇、缬氨酸5种物质含量升高。这些差异代谢物与三羧酸循环、糖异生、糖酵解、丙氨酸代谢、肌醇代谢、脂肪酸代谢、脯氨酸代谢、神经递质传导等多个代谢通路相关。3、生活方式干预阳虚体质的血浆代谢组研究采用PCA方法对对照组干预前后(干预前n=10,干预后n=10)样本建模,累计计算出4个主成分,模型参数R2X=0.968,Q2X=0.879,模型分析了 96.8%的原始数据,累计贡献率为87.9%。两组之间有所分离,进一步采用OPLS-DA方法建模。累计计算出2个主成分,模型参数R2X=0.783,R2Y=0.854,Q2X=0.771。在OPLS-DA模型中提取VIP值>1的变量,对其归一化积分值进行统计学分析,发现生活方式干预前后血浆中对分类贡献较大的差异代谢物有9个,即缬氨酸、乳酸、脯氨酸、胆碱、精氨酸、肌醇、亮氨酸、肌酸、3-羟基丁酸。生活方式干预后以上物质含量均升高。这些差异代谢物与三羧酸循环、糖异生、糖酵解、脂肪酸代谢、肌醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等多个代谢通路相关。4、桂附地黄丸干预阳虚体质的血浆代谢组研究采用PCA方法对试验组用药前后(干预前n=10,干预后n=10)样本建模,累计计算出4个主成分,模型参数R2X=0.896,Q2X=0.646,模型分析了 89.6%的原始数据,累计贡献率为64.6%。两组之间有所分离,进一步采用OPLS-DA方法建模。累计计算出2个主成分,模型参数R2X=0.732,R2Y=0.705,Q2X=0.550。在OPLS-DA模型中提取VIP值>1的变量,对其归一化积分值进行统计学分析,发现桂附地黄丸干预前后血浆中对分类贡献较大的差异代谢物有11个,即缬氨酸、异亮氨酸、乳酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、甜菜碱、α-葡萄糖、丙二醇和3-羟基丁酸。与干预前相比,干预后以上血浆差异代谢物含量均上升。这些差异代谢物与三羧酸循环、糖异生、糖酵解、胆汁酸生物合成,脂肪酸代谢、丙氨酸代谢、肌醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、神经递质传导等多个代谢通路相关。结论1、阳虚体质潜在的分子标志物有11个,其中乳酸、丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、3-羟基丁酸、α-葡萄糖水平降低,氧化三甲胺、胆碱、甘氨酸、肌醇、缬氨酸水平升高。表明阳虚体质是一种以新陈代谢减缓,产能减少为表现的体质类型,存在糖脂代谢、氨基酸代谢、三羧酸循环、神经递质等代谢通路的改变。2、健康促进生活方式可以达到调理阳虚体质效果,对健康状态有一定的改善作用,但是起效较为缓慢。3、桂附地黄丸短期内即可显著改善阳虚体质和健康状态,长期随访也表明疗效显著。作用机制可能与其提高丙氨酸、谷氨酰胺和α-葡萄糖的含量,增加机体产能有关。