维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是一种人兽鱼共患病原菌,能够长时间存在于水体中,并感染鱼虾蟹龟等水生生物患病,严重危害水产养殖业的发展。虽然合理使用抗生素能够减少部分致病性维氏气单胞菌带来的损失,但是人们大量使用抗生素致使细菌产生耐药性,同时抗生素又不能解决鱼类感染细菌后快速传播的问题。水产疫苗作为一种快速有效的预防鱼类细菌感染的方式能够解决这些问题的同时又不会给鱼体本身损害。麦芽糖孔蛋白是A.veronii的一种外膜膜孔黏附蛋白,具有较强的免疫原性,可作为基因工程疫苗抗原候选基因。而分子佐剂可以提高基因工程疫苗的蛋白表达,增强疫苗的稳定性与安全性,因此分子佐剂的研究已成为加强疫苗免疫的研究热点。本研究克隆了A.veronii TH0426株malt基因,鲫鱼IFN-γ基因,通过SOE-PCR将malt基因和IFN-γ基因重叠扩增,结果显示成功扩增出1800 bp左右大小的目的片段。对malt基因进行原核表达后,构建分别具有三种重组质粒p PG-malt,p PG-INF-γ与p PG-malt-INF-γ的干酪乳杆菌393,测序结果显示成功构建重组干酪乳杆菌。为研究分子佐剂增强疫苗的效果,将重组乳酸菌经乳糖诱导后包被在鱼饲料上采用口服免疫的方式投喂鲫鱼,于免疫前0 d,免疫后7 d,16 d,25 d,34 d对免疫鲫鱼进行血清和组织肝、脾、肾、肠的采集。ELISA方法测定血清中的Ig M、ACP、AKP、SOD、LYS、C3、C4含量,结果显示Lc-p PG-malt组和Lc-p PG-malt-IFN-γ组的免疫鲫鱼血清中Ig M水平显著升高,非特异性相关免疫酶C3、C4、AKP、ACP、SOD、LYS活性显著上升,说明重组乳杆菌Lc-p PG-malt和Lc-p PG-malt-IFN-γ能够增强鲫鱼的体液免疫。白细胞吞噬试验结果显示Lc-p PG-malt组和Lc-p PG-malt-IFN-γ组吞噬活性和吞噬比率较其对照组有明显增加。通过荧光定量PCR测定对口服免疫的鲫鱼的肝、脾、头肾、肠组织的与免疫相关基因的表达量,结果表明各个组织的IL-8、IL-10、TRAF-6、My D88、TNF-α及IL-1β的转录水平表现出明显的上升趋势,说明重组乳杆菌可增强细胞免疫因子的转录水平,并增强细胞免疫应答能力。采集空腹处理7 d后的鲫鱼的肠道,分离前肠、中肠、后肠,采用梯度稀释平板计数法,结果表明重组乳杆菌可在后肠中更好地定植。攻毒保护试验结果表明,Lc-p PG-malt和Lc-p PG-malt-IFN-γ重组乳杆菌均对鲫鱼起到保护作用,Lc-p PG-malt-IFN-γ组相对免疫保护率更高。Lc-p PG-malt-IFN-γ组与Lc-p PG-malt组相比其免疫指标均有所提高,说明IFN-γ作为分子佐剂能够明显提高重组乳杆菌的免疫效果。而Lc-p PG-IFN-γ组与Lc-p PG组结果几乎一致,没有增强免疫效果。综上所述,本研究构建了以IFN-γ为分子佐剂的表达A.veronii malt基因的乳酸菌疫苗,口服免疫鲫鱼,能增强血清中Ig M水平和相关免疫酶活性,使细胞因子转录水平呈上升趋势,增强白细胞的吞噬能力,刺激动物机体发生强而有力的免疫应答,提升疫苗的免疫效果。本研究的创新点是:首次将鲫鱼头肾IFN-γ基因和A.veronii malt基因融合重组到干酪乳杆菌中,作为水产疫苗免疫鲫鱼测定其免疫指标和保护率评价免疫效果。研究结果旨在评价新型基因工程疫苗的免疫能力,为乳酸菌活载体疫苗在水产上的应用提供理论依据。