论文部分内容阅读
背景:乳腺癌(Breast Cancer)是全球主要的公共卫生问题之一,也是女性最为常见的恶性肿瘤,且其发病率仍呈持续上升的趋势,严重威胁到全球女性的生命健康。根据2020年美国癌症协会期刊《CA Cancer J Clin》发表的2020年全美肿瘤预估报告显示,在美国女性肿瘤发生率的排名中,乳腺癌已经超越肺癌成为首位。尽管近年来在基础研究中取得了较大的进展,但乳腺癌的防治仍是亟需解决的重要问题。NUDT21是一种RNA结合蛋白,在多种生物反应的调节中起着重要作用,且与肿瘤的发生发展息息相关。同时与乳腺癌细胞的增殖,侵袭和迁移以及上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生有着不可或缺的关系。探明NUDT21对乳腺癌发生发展的作用和机制可为乳腺癌的诊断和治疗提供新思路,NUDT21也可能作为乳腺癌检测的新标志物。目的:探讨NUDT21在乳腺癌中是否通过调节CPSF6抑制其发生发展;分析NUDT21对乳腺癌细胞的增殖,侵袭和迁移以及EMT的影响。方法:1)通过蛋白质印迹(western blot)方法检测NUDT21在乳腺癌细胞系,正常乳腺上皮细胞中的蛋白表达情况。2)通过免疫组织化学(immunochemistry,IHC)方法检测100例乳腺癌组织和100例乳腺良性组织中NUDT21的蛋白表达情况。3)应用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)方法检测过表达的乳腺癌细胞系中NUDT21的表达水平。4)选取NUDT21表达较低的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT-549细胞,靶向转染过表达质粒以上调NUDT21的表达。5)检测MDA-MB-231和BT-549细胞,通过MTT实验,克隆形成实验,细胞侵袭和迁移实验观察过表达NUDT21的表达对乳腺癌细胞增殖和转移的影响。6)通过免疫蛋白印迹检测MDA-MB-231和BT-549细胞中EMT标记物的表达情况。7)选取NUDT21表达较高的乳腺癌细胞系MCF-7和T47D细胞,靶向转染NUDT21 sh-RNA以下调NUDT21的表达。8)检测MCF-7和T47D细胞,通过MTT实验,克隆形成实验,细胞侵袭和迁移实验观察敲低NUDT21的表达对乳腺癌细胞增殖和转移的影响。9)通过免疫蛋白印迹检测MCF-7和T47D细胞中EMT标记物的表达情况。10)应用质谱分析和免疫印迹来鉴定NUDT21与CPSF6是否存在直接相互作用。11)在乳腺癌细胞株MCF-7中靶向转染CPSF6的si RNA以下调CPSF6表达。12)在低表达NUDT21的乳腺癌细胞MCF-7中转染CPSF6的si RNA,探讨CPSF6对NUDT21调节乳腺癌细胞系生物学行为的影响及其作用机制。结果:1)Western blot实验结果显示在乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞中,NUDT21在MDA-MB-231和BT-549细胞中表达较低,而在MCF-7和T47D细胞中表达较高。2)RT-q PCR分析显示乳腺癌患者NUDT21的m RNA表达水平显著低于乳腺良性组织(P<0.05)。免疫组织化学分析显示,与良性乳腺疾病组织相比,NUDT21在乳腺癌组织中的表达明显降低(P<0.05)。在100例良性乳腺疾病组织阳性表达率为74.0%(74/100),100例乳腺癌组织中阳性表达率为42.0%(42/100),且差异具有统计学意义(P<0.001)。3)Western blot实验结果显示转染过表达NUDT21的质粒后,乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT-549细胞中NUDT21的蛋白表达量显著上升。MTT实验结果显示,与对照组相比,实验组中的细胞增殖能力降低。Transwell实验结果表明,实验组中细胞的侵袭和迁移能力受到明显抑制(P<0.001)。4)Western blot实验结果显示在乳腺癌细胞系MCF-7和T47D细胞中靶向转染NUDT21 si RNA后,MCF-7和T47D细胞中的NUDT21表达量显著下降。随后进行细胞功能实验,与对照组相比,实验组中的细胞增殖能力,细胞侵袭和迁移能力增强。5)Western blot实验结果显示在NUDT21过表达的BT-549细胞中,我们发现E-钙粘蛋白(E-cadherin)和Occludin的表达增加,而波形蛋白(Vimentin,Vim)和ZEB-1的表达降低。相反,在NUDT21敲低的MCF-7细胞中,我们发现E-cadherin和Occludin的表达降低,Vim和ZEB-1表达增加。6)质谱结果分析得出,NUDT21与CPSF6之间的相关性最为显著。自此,我们选择CPSF6作为我们下一步的研究对象。7)Western blot实验结果显示在乳腺癌细胞MCF-7中转染si-CPSF6后,CPSF6的蛋白表达量下降。进行细胞功能实验,与对照组相比,MTT实验结果显示,实验组的细胞增殖能力明显降低。Transwell实验结果表明,实验组中细胞侵袭和迁移能力也有所降低。8)在敲低NUDT21的乳腺癌细胞MCF-7中,转染si-CPSF6/si-Control。在Transwell实验中si-CPSF6组相对于si-Control细胞的迁移和侵袭能力降低(P<0.001)。结论:NUDT21调节乳腺癌中EMT标记蛋白的表达并抑制NUDT21/CPSF6信号通路,从而发挥抑癌作用。