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研究目的近年来，随着人们生活水平的不断提高，商品隅鸪市场需求不断增多。在养殖场和活禽市场，人们往往将盹鸪与陆禽鸡、鹊辑和水禽鸭、鹅与等混养出售，禽流感病毒在这些宿主群体当中相互传播并反复感染后，经过漫长地适应性改变，其HA受体结合位点很可能发生改变，甚至发生基因重配以形成新亚型的病毒，从而获得感染人的能力。分子流行病学调查发现，一些禽流感病毒在鹏鸪流行并己建立稳定谱系，提示鹏鸪在流感病毒生态系统中也可能起中间宿主的作用，但是其分子机制国内外尚未见报道。本文系统地检测鹏鸪禽流感病毒SAα-2，3Gal和人流感病毒SAα-2，6Gal唾液酸受体的分布，初步探讨鹏鸪在流感病毒跨种属传递和进化中的作用，为监测和追踪流感病毒从水禽类到适应人类的进化过程、为选择监测流感病毒宿主提供基础。
方法:1.检测SAα-2,3Gal与SAα-2.6Gal唾液酸受体免疫组化法:石蜡切片脱蜡至水，分别滴加SNA(O.25μg/ml)与MAA-Ⅱ(1.25μg/ml)于组织切片上，SNA特异性标记SAα-2，6Gal受体，MAA-Ⅱ特异性标记SAα-2.3Gal受体，置4℃冰箱过夜，PBS冲洗C5min×3次)，滴加R.T.U.HorseradishPeroxidaseStreptavidin溶液，室温孵育30min，PBS冲洗(5min×3次)，用现配DAB溶液染色显色，自来水冲洗，苏木素复染、酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，光学显微镜下观察结果。阳性、阴性对照:MAA-Ⅱ阳性对照为鸭结肠组织、SNA阳性对照为人气管组织;MAA-Ⅱ阴性对照为人气管组织、SNA阴性对照为鸭结肠组织。判定结果:普通光学显微镜下，阳性结果为上皮细胞表面染成棕黄色。2.流感病毒标记与结合实验用MDCK细胞接种传代培养人流感病毒A/ST/92/09(H1N1)，用鸡胚培养禽流感病毒DK/ST/1588/00(H9N1)。用0.03％甲醒灭活病毒液72h，展糖溶液超速离心纯化病毒，缓冲液置换，用荧光素Alexa48标记病毒、于摇床上摇1h，将标记的病毒液转至MicroconYM-100,PBS冲洗(5min×3次)，冲洗未结合病毒的荧光素Alexa48。组织切片经过脱蜡至水后，滴加己标记的病毒，置4％冰箱过夜，PBS冲洗(5min×3次)，中性树胶封片。阳性、阴性对照:禽流感病毒H9N1阳性对照为鸭结肠组织、人流感病毒HIN1阳性对照为人气管组织:禽流感病毒H9Nl阴性对照为人气管组织、人流感病毒HIN1阴性对照为鸭结肠组织。判定结果:荧光显微镜下，细胞膜出现绿色荧光为阳性结果。
结果:1.SAα-2，3Gal和SAα-2，6Gal受体的分布特点SAα-2，3Gal受体强阳性弥漫分布于各个检测部位，经过统计学分析，SAα-2，3Gal受体在鹏鸪呼吸道气管至副支气管以及结肠这几个部位的分布没有明显差异(P＞0.05);SAα-2，6Gal受体呈强阳性弥漫分布于呼吸道气管至次级支气管，而在副支气管、消化道结肠上皮细胞不表达或表达极少量，经统计学分析，SAα-2，6Gal受体在呼吸道气管至次级支气管的分布与副支气管、结肠的分布有明显差异(P＜O.O1)，此受体在呼吸道气管至次级支气管的分布高于在副支气管和结肠的分布。再比较SAα-2，3Gal和α-2，6Gal两种受体在各部位的分布特点，SAα-2，3Gal受体和SAα-2，6Gal受体在气管至次级支气管的分布基本一致，而在副支气管和结肠部位，两种受体的表达有明显差异(P＜O.O1)，SAα-2，3Gal受体的表达比SAα么6Gal受体的表达显著性增高。因此，SAα-2，3Gal和SAα-2，6Gal受体在鹏鸪体内均有表达，但SAα-2，6Gal受体在副支气管与消化道部位表达缺乏或仅表达极少量。2.病毒结合实验呼吸道各部位和消化道结肠均能结合H9N1亚型病毒，并且各部位间的病毒结合特点没有明显差异，说明鹏鸪呼吸道各部位与消化道结肠上皮细胞均可以被结合SAα-2，3Gal受体的禽流感病毒DKJST/1588/00(H9N1)感染。同样，气管至次级支气管可以被结合SAα-2，6Gal受体的人流感病毒A/ST/92/09(H1N1)感染，但未见副支气管与结肠上皮细胞被感染。由此可见，病毒结合实验的结果与受体的分布趋于一致，进一步验证了鹏鸪呼吸道与消化道结肠上皮细胞SAα-2，3Gal与SAα-2，6Gal受体的分布特点。
结论:
1.SAα-2，3Gal唾液酸受体在鹏鸪呼吸道气管至支气管与消化道结肠上皮细胞呈强阳性表达;SAα-2.6Gal唾液酸受体在呼吸道气管至次级支气管上皮细胞呈强阳性表达，而在副支气管、消化道结肠上皮细胞缺乏或极少量表达。
2.鹏鸪呼吸道组织对H9N1流感病毒敏感，气管至副支气管与消化道结肠组织均较易结合H9N1禽流感病毒，与SAα-2，3Gal唾液酸受体在相应部位的分布基本一致:呼吸道气管、支气管、次级支气管组织较易结合HIN1人流感病毒，副支气管、消化道结肠组织不结合或极少量结合该病毒，此结果与SAα-2，6Gal唾液酸受体在相应部位的分布基本一致。
3.鹏鸪同时表达禽流感病毒SAα-2，3Gal和人流感病毒SAα-2，6Gal两种唾液酸受体。鹏鸪呼吸道能与禽流感病毒和人流感病毒结合，有助于禽流感病毒与人流感病毒基因重配，提示其可充当流感病毒潜在的中间宿主。
方法:1.检测SAα-2,3Gal与SAα-2.6Gal唾液酸受体免疫组化法:石蜡切片脱蜡至水，分别滴加SNA(O.25μg/ml)与MAA-Ⅱ(1.25μg/ml)于组织切片上，SNA特异性标记SAα-2，6Gal受体，MAA-Ⅱ特异性标记SAα-2.3Gal受体，置4℃冰箱过夜，PBS冲洗C5min×3次)，滴加R.T.U.HorseradishPeroxidaseStreptavidin溶液，室温孵育30min，PBS冲洗(5min×3次)，用现配DAB溶液染色显色，自来水冲洗，苏木素复染、酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，光学显微镜下观察结果。阳性、阴性对照:MAA-Ⅱ阳性对照为鸭结肠组织、SNA阳性对照为人气管组织;MAA-Ⅱ阴性对照为人气管组织、SNA阴性对照为鸭结肠组织。判定结果:普通光学显微镜下，阳性结果为上皮细胞表面染成棕黄色。2.流感病毒标记与结合实验用MDCK细胞接种传代培养人流感病毒A/ST/92/09(H1N1)，用鸡胚培养禽流感病毒DK/ST/1588/00(H9N1)。用0.03％甲醒灭活病毒液72h，展糖溶液超速离心纯化病毒，缓冲液置换，用荧光素Alexa48标记病毒、于摇床上摇1h，将标记的病毒液转至MicroconYM-100,PBS冲洗(5min×3次)，冲洗未结合病毒的荧光素Alexa48。组织切片经过脱蜡至水后，滴加己标记的病毒，置4％冰箱过夜，PBS冲洗(5min×3次)，中性树胶封片。阳性、阴性对照:禽流感病毒H9N1阳性对照为鸭结肠组织、人流感病毒HIN1阳性对照为人气管组织:禽流感病毒H9Nl阴性对照为人气管组织、人流感病毒HIN1阴性对照为鸭结肠组织。判定结果:荧光显微镜下，细胞膜出现绿色荧光为阳性结果。
结果:1.SAα-2，3Gal和SAα-2，6Gal受体的分布特点SAα-2，3Gal受体强阳性弥漫分布于各个检测部位，经过统计学分析，SAα-2，3Gal受体在鹏鸪呼吸道气管至副支气管以及结肠这几个部位的分布没有明显差异(P＞0.05);SAα-2，6Gal受体呈强阳性弥漫分布于呼吸道气管至次级支气管，而在副支气管、消化道结肠上皮细胞不表达或表达极少量，经统计学分析，SAα-2，6Gal受体在呼吸道气管至次级支气管的分布与副支气管、结肠的分布有明显差异(P＜O.O1)，此受体在呼吸道气管至次级支气管的分布高于在副支气管和结肠的分布。再比较SAα-2，3Gal和α-2，6Gal两种受体在各部位的分布特点，SAα-2，3Gal受体和SAα-2，6Gal受体在气管至次级支气管的分布基本一致，而在副支气管和结肠部位，两种受体的表达有明显差异(P＜O.O1)，SAα-2，3Gal受体的表达比SAα么6Gal受体的表达显著性增高。因此，SAα-2，3Gal和SAα-2，6Gal受体在鹏鸪体内均有表达，但SAα-2，6Gal受体在副支气管与消化道部位表达缺乏或仅表达极少量。2.病毒结合实验呼吸道各部位和消化道结肠均能结合H9N1亚型病毒，并且各部位间的病毒结合特点没有明显差异，说明鹏鸪呼吸道各部位与消化道结肠上皮细胞均可以被结合SAα-2，3Gal受体的禽流感病毒DKJST/1588/00(H9N1)感染。同样，气管至次级支气管可以被结合SAα-2，6Gal受体的人流感病毒A/ST/92/09(H1N1)感染，但未见副支气管与结肠上皮细胞被感染。由此可见，病毒结合实验的结果与受体的分布趋于一致，进一步验证了鹏鸪呼吸道与消化道结肠上皮细胞SAα-2，3Gal与SAα-2，6Gal受体的分布特点。
结论:
1.SAα-2，3Gal唾液酸受体在鹏鸪呼吸道气管至支气管与消化道结肠上皮细胞呈强阳性表达;SAα-2.6Gal唾液酸受体在呼吸道气管至次级支气管上皮细胞呈强阳性表达，而在副支气管、消化道结肠上皮细胞缺乏或极少量表达。
2.鹏鸪呼吸道组织对H9N1流感病毒敏感，气管至副支气管与消化道结肠组织均较易结合H9N1禽流感病毒，与SAα-2，3Gal唾液酸受体在相应部位的分布基本一致:呼吸道气管、支气管、次级支气管组织较易结合HIN1人流感病毒，副支气管、消化道结肠组织不结合或极少量结合该病毒，此结果与SAα-2，6Gal唾液酸受体在相应部位的分布基本一致。
3.鹏鸪同时表达禽流感病毒SAα-2，3Gal和人流感病毒SAα-2，6Gal两种唾液酸受体。鹏鸪呼吸道能与禽流感病毒和人流感病毒结合，有助于禽流感病毒与人流感病毒基因重配，提示其可充当流感病毒潜在的中间宿主。