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目的：研究利用体外活化抗原提呈细胞提高人骨肉瘤免疫原性的手段，研究人骨肉瘤抗原进入提呈细胞的有效途径和方法。探讨人骨肉瘤细胞诱发凋亡并经活化的抗原提呈细胞吞噬后对其免疫原性的影响；探索筛选制备人骨肉瘤与活化B淋巴细胞融合瘤的方法，并研究其体外免疫原性；揭示它们作为人骨肉瘤免疫疫苗的可能性，为进一步临床应用做有意义的前期实验。 方法：（1）过氧化氢H2O2的完全培养基诱发人骨肉瘤细胞PL-11凋亡的浓度和时间筛选，流式细胞仪分析细胞DNA含量和细胞周期。正常献血者粗分白细胞悬液离心沉降法得人外周血单个核细胞，粘附法分离出外周血单核细胞并预激活，同时预培养分离所得混合淋巴细胞。激活单核细胞分别与凋亡PL-11细胞裂解物和未凋亡PL-11细胞裂解物和预培养淋巴细胞孵育7天（PL-11a组及PL-11u组），另设单纯淋巴细胞与凋亡细胞裂解物培养组（Control组）和激活单核细胞与淋巴细胞共培养组（MON组），计数法测量增殖。各组培养所得淋巴细胞进行体外杀伤实验（效靶比50:1），改良MTT法测量杀伤指数KI。 （2）抗人Ig-M、金黄色葡萄球菌A蛋白及少量IL-2和PMA活化的人脾脏来源B淋巴细胞，以500mg/ml聚乙二醇为融合剂，使骨肉瘤细胞与活化B淋巴细胞进行化学融合，贴壁后去除未融合淋巴细胞，特异性抗B细胞抗体预包被平板捕捉与B细胞融合的骨肉瘤。条件培养基体外筛选扩增，检测融合效率。紫外线灭活，同时设单纯灭活的未融合骨肉瘤组作为对照，记数法测量各组刺激淋巴细胞增殖能力，各组培养所得淋巴细胞进行体外杀伤实验（效靶比50:1），改良MTT法测量淋巴细胞对亲源之骨肉瘤细胞的杀伤指数。 结果（1）10-100nmol/L浓度H2O2 RPMI-1640完全培养基（10％FCS）在7小时之内均无法诱导人骨肉瘤凋亡，但是于14小时后10nmol/L，50nmol/L，75nmol/L，100nmol/L等各浓度组均可诱导凋亡，且存在量效和时效相关性， 第四军医大学硕士学位论文一100nmol／L处理36小时者最明显＊．6％卜PL＋ 组仅有较弱的刺激淋巴细胞增殖作用，PL－11a组淋巴细胞体外增殖显著（P＜0．01），Control组和 MON组均无明显淋巴细胞增殖现象。同时PL、U组仅有较弱的淋巴细胞杀伤作用（3．90o），PL－11a组则有明显的增强（9．180），而Control 组及MON 组培养所得淋巴细胞均无杀伤作用。 u)人B淋巴细胞体外激活后可以与人骨肉瘤细胞化学融合，可利用贴壁性质和特异性B淋巴细胞抗体等方法部分纯化融合细胞并适当扩增浓集。融合细胞于 3周和 4周表达B淋巴细胞的标志性抗原效率分别为 60．6％和 45．4趴 紫外线灭活融合瘤明显提高其体外刺激淋巴细胞增殖能力 o＜0刀1入 诱发淋巴细胞对亲源骨肉瘤细胞的杀伤作用门1石0％且2＜0刀1) 结论：人骨肉瘤细胞在 H刃。诱发凋亡后，如经活化 ApC吞噬其裂解产物，可显著提高其体外免疫原性而引出针对肿瘤的杀伤效力；另一方面利用人骨肉瘤细胞和活化 B淋巴细胞可以制备融合瘤，融合瘤显著提高亲源骨肉瘤的体外免疫原性，引发体外抗瘤免疫。这提示利用活化外周血中单核细胞处理凋亡之骨肉瘤的肿瘤疫苗方法是可行的；而利用细胞融合方法快速构建人骨肉瘤与 B细胞融合瘤的瘤苗方案也是简便有效的，这两种方法对于人骨肉瘤的主动兔疫治疗有重要实践意义，可能成为现实的利用活化 ApC中介的个体化肿瘤疫苗新方案。