烟草赤星病(Brown-spot)是一种由链格孢菌(Alternaria alternate)引起的世界性真菌病害,具有发病快,难治愈等特性,赤星病病原菌侵染烟草叶片后会破坏叶片完整性,改变叶片化学成分,严重影响烟草品质,从而造成巨大经济损失。使用化学药物防治烟草赤星病不仅污染环境,还会损害烟叶品质。目前来讲,解决这一问题的关键在于培育高抗赤星病的烟草品种。抗赤星病的烟草种质资源非常有限,充分发掘现有抗性资源进行优质烟草品种的抗性改良是烟草抗性育种的重要课题。然而烟草的病害抗性应答是一个复杂的生理、病理过程,涉及多个遗传因子和功能基因,利用现代生物技术,从分子水平揭示烟草赤星病抗性应答的作用机制对烟草抗性育种具有重要理论价值。目前植物激素信号转导途径及其中关键调控因子和靶基因的调控表达研究已成为植物分子抗逆育种领域的热点内容。植物主要激素茉莉酸、乙烯和水杨酸在植物病害应答中发挥重要作用,通过各信号途径之间的相互拮抗或协同作用形成了复杂有序的植物激素调控网络。病害侵染会激活植物的激素合成,并诱导下游病程相关基因(pathogenesis-related genes,PR)等防卫基因的表达,从而增强植物的病害抗性。植物激素激活病程相关蛋白的表达需要一系列调控蛋白参与,在激素信号传导途径中,上游的激酶及转录调控因子等在病程相关蛋白的表达调控中起重要作用,是影响植物病害抗性的重要因素。K326是我国广泛种植的一个高品质烟草品种,比较分析其与抗赤星病材料Beinhart1000-1之间的分子差异,开发赤星病抗性标记,并对K326进行品种抗性改良具有很好的应用价值。本研究首先通过植物生理和分子生物学研究技术,比较分析了高抗赤星病的烟草品种Beinhart 1000-1与赤星病敏感栽培种K326之间的病害抗性差异。Beinhart 1000-1在接种赤星病病原菌后,叶片出现局部坏死病斑,但病斑不发生扩散,表现出对赤星病良好抗性;但K326在接种赤星病病菌后,叶片很少发生坏死,通常病斑会持续扩散,直至整个叶片腐烂,表现出对赤星病的敏感性。进一步利用定量RT-PCR技术,本研究着重分析了11个PR基因及3个转录因子家族(WRKY,bHLH和AP2/EREBP)的16个基因在Beinhart 1000-1和K326应答赤星病病原菌和植物激素(茉莉酸和乙烯)处理过程中的表达差异,揭示了二者抗性差异的分子基础。研究结果发现:1.Beinhart1 000-1和K326间PR基因及转录因子对赤星病病原菌的敏感性差异明显通过对比分析接种赤星病病原菌后Beinhart 1000-1和K326中相关基因的相对表达量发现,候选的11个PR基因中有9个在Beinhart 1000-1中表现出对赤星病病原菌更加强烈的敏感性,分别是PR1a,PRB-1b,PR3a,PRQ,PRR,PR4,PR5,PR3b和Gluc;16个分别属于3个家族(AP2/EREBP,bHLH和WRKY)的候选转录因子中有13个,即ERF1,ERF2,ERF3b,ERF8,ERF32,ERF168,EREBP1,CEF1,XP1,TSi1,WRKY4,WRKY11和MYC2在Beinhart1000-1中表现出对赤星病病原菌更加强烈的敏感性。2.Beinhart1 000-1和K326间PR基因及转录因子对茉莉酸及乙烯的敏感性差异明显通过对比分析茉莉酸处理后后Beinhart 1000-1和K326中相关基因的相对表达量发现,PR基因中的PRB-1b,PR5,Gluc和PRR尤其在Beinhart 1000-1中表现出对茉莉酸更加强烈的敏感性;转录因子中的ERF8,TSi1,XP1,WRKY11和MYC2在Beinhart 1000-1中表现出对茉莉酸更加强烈的敏感性。同时通过对比分析乙烯处理后Beinhart 1000-1和K326中相关基因的相对表达量,发现PR基因中的PRB-1b,PR5,Gluc和PR3b在Beinhart 1000-1中表现出对乙烯更加强烈的敏感性;转录因子中的ERF8,ERF168和WRKY11在Beinhart 1000-1中的表现出对乙烯的更加强烈敏感性。研究还发现,茉莉酸,乙烯和病原菌能够同时强烈诱导Beinhart 1000-1中的PR5,Gluc和PRB-1b及上游转录因子基因WRKY11和ERF8的表达,但不能以同样的效果诱导相关基因在K326中的表达,揭示烟草的赤星病抗病调控途径可能为:烟草在受到赤星病病原菌侵害后,启动茉莉酸和乙烯的合成途径,从而激活茉莉酸和乙烯信号转导途径,进一步由相关转录因子WRKY11/ERF8调控激发下游关键靶基因PR5/Gluc/PRB-1b的表达从而使机体产生对赤星病的抗性。另外作为茉莉酸信号途径中的关键性转录因子,MYC2在烟草中受到赤星病病原菌和茉莉酸的诱导,并且其在Beinhart 1000-1中的绝对表达量远超过其在K326中的表达水平,表明茉莉酸信号途径可能在Beinhart 1000-1对抗赤星病的免疫应答反应中起主导作用。进一步的种子萌发及幼苗生长发育试验也证明,Beinhart 1000-1对茉莉酸具有强烈的敏感性。茉莉酸能够强烈抑制Beinhart 1000-1种子萌发,抑制其幼苗叶片和根的生长发育,而且感病材料K326对茉莉酸的敏感性远低于抗病材料Beinhart 1000-1。上述研究结果表明茉莉酸信号途径在烟草的赤星病抗性调控中发挥重要作用。