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研究背景鼻咽癌在中国南方地区有着较高的发病率,严重影响当地人民的生活质量。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗方式。爱必妥(Cetuximab,C225)是针对表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)的一种单克隆抗体,在鼻咽癌病人治疗中,可以作为放疗的增敏剂。糖基转移酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V(GnT-V)能催化N-糖链的β1,6分支形成。GnT-V及其产物β1,6糖链分支参与了多种肿瘤的侵袭和转移。本课题组前期实验证实:下调GnT-V的表达能增加鼻咽癌细胞对放疗的敏感性。另有文献证实:GnT-V可通过改变细胞膜表面受体上的β 1,6-糖链,影响信号活化传导而导致化疗耐药或放疗抵抗。由于GnT-V及其糖基化产物β 1,6-糖链能影响鼻咽癌的放疗敏感性;细胞膜表面受体上N-糖链的改变能影响放疗抵抗;且C225是针对EGFR的单克隆抗体,因此我们猜想:GnT-V可能通过调节EGFR上的糖基化水平,从而影响C225对鼻咽癌细胞的放疗敏感性。研究目的探讨GnT-V是否通过调节EGFR的N-糖链β-1,6分支结构影响C225的放疗增敏作用,通过本项目研究,进一步丰富C225放疗增敏作用的分子机制。研究方法1.慢病毒转染鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2,干扰GnT-V表达。2.RNA提取及RT-PCR测mRNA表达。3.免疫印迹Western blot检测蛋白质表达4.凝集素实验用PHA-L检测总β1-6糖链表达。5.细胞功能学实验检测肿瘤细胞恶性行为学。6.裸鼠皮下成瘤实验及分割放射治疗。7.免疫组化用PHA-L测裸鼠皮下肿瘤β1-6糖链水平。8.统计学分析。结果1.构建稳定低表达GnT-V的鼻咽癌细胞株及检测干扰效果用慢病毒为载体的shRNA干扰鼻咽癌细胞CNE1,CNE2中GnT-V的表达,建立稳定低表达GnT-V细胞株。2.GnT-V联合C225对鼻咽癌细胞放疗的影响(1)测量鼻咽癌细胞中C225的半抑制浓度(IC50)CNE1和CNE2细胞中,测得C225的IC50值分别为:717μg/ml和1244μg/ml。有文献指出:当药物在细胞实验中作为放疗增敏剂时,其实际应用浓度应为IC50值的五分之一[1]。因此在本实验中,C225作为鼻咽癌细胞放疗增敏剂的实验浓度分别为:143μg/ml和249μg/ml。无射线条件下,五分之一的IC50值浓度的C225,对CNE1与CNE2两组细胞的增殖活性无影响。(2)下调GnT-V联合C225能增加鼻咽癌细胞对放疗的敏感性两株鼻咽癌细胞各分为“放射组”、“下调+放射组”、“C225+放射组”、“下调+C225+放射组”。由克隆形成实验、迁移划痕实验、增殖活性实验及流式细胞实验证实:“放射组”的克隆形成率、细胞存活率和迁移划痕率最高,凋亡率最低;“下调+C225+放射组”克隆形成率、细胞存活率和迁移划痕率最低,凋亡率最高。3.探讨下调GnT-V增加C225的放疗敏感性与EGFR上β1-6糖链的关系。(1)用苦马豆碱(SW)抑制高表达GnT-V的CNE2细胞株上的β1-6糖链,随后将细胞分为“放射组”,“放射+SW组”“放射+SW+C225组”。由克隆形成实验、迁移划痕实验、增殖活性实验证实:克隆形成能力、迁移能力以及细胞活力由高至低分别是:“放射组”,“放射+SW组”“放射+SW+C225组”。因此,β1-6糖链与C225的放疗增敏相关。(2)CNE1,CNE2两株细胞的各个实验组中,EGFR的mRNA、蛋白水平均无统计学差异。但用凝集素实验检测各实验组中β1-6糖链的水平发现:“放射组”糖链水平最高,“放射+下调+C225组”水平最低。随后用免疫沉淀方法验证EGFR上的β1-6糖链,亦发现:“放射组”中EGFR的β1-6糖链水平最高;“放射+下调+C225组”中EGFR的β1-6糖链水平最低。因此,GnT-V影响C225的放射增敏机制可能是由于改变了 EGFR上的β1-6糖链。4.下调GnT-V联合C225在放疗条件下对裸鼠成瘤的影响(1)裸鼠肿瘤生长速度,“放射组”的最快,“下调+C225+放射组”最慢。(2)免疫组化实验用PHA-L测量裸鼠皮下肿瘤的β1,6糖链表达水平。发现实验组中生长速度快的肿瘤中β1,6糖链的含量更高。5.GnT-V影响C225放疗敏感性的可能信号通路探究EGFR下游PI3K/AKT通路发现,各实验组磷酸化PI3K和磷酸化AKT的水平不同。实验结果发现,对射线更敏感的细胞,p-PI3K及p-AKT水平更低。结论1.靶向GnT-V的shRNA真核表达慢病毒可以显著下调GnT-V的mRNA和蛋白表达。2.下调GnT-V能进一步增加C225的放疗增敏效果。3.GnT-V影响C225的放疗敏感性可能是通过改变EGFR上的β 1-6糖链。4.下调GnT-V联合C225在放疗条件下能减慢裸鼠肿瘤生长。5.GnT-V联合C225影响放疗敏感性可可与PI3K/AKT通路相关。