人类免疫缺陷病毒(HIV),是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒,该病毒属于逆转录病毒科,慢病毒属。同所有逆转录病毒一样含有两条基本相同的正链RNA作为基因组。逆转录病毒基因组的复制,是在逆转录酶(RT)的作用下,以病毒RNA基因组为模板,经过两次精确的链转移步骤(与模板分离/再结合),逆转录成两端分别带有相同LTR的双链前病毒DNA基因组而完成。迄今为止,研究者对病毒逆转录过程中链转移的研究一般使用三个系统:第一个系统应用两个携带不同RNA基因组病毒的单轮感染系统。在该系统中进行逆转录反应时,逆转录酶可以在同一模板不同位点或不同模板之间发生链转移作用。然而,只有发生在同一方向的链转移才可能产生可以整合到宿主细胞基因组中的双链前病毒DNA。这样的链转移现象很容易通过前病毒DNA测序方法被检测到。但如果逆转录过程异常终止,或发生方向相反的异常链转移就可能产生两端缺失LTR的DNA产物,不能完成前病毒DNA的整合步骤,故而这样的逆转录产物无法被检测到。第二个系统使用一对供体RNA和受体RNA,利用标记性逆转录引物起始逆转录反应,当c DNA沿“供体RNA”逆转录至模板的5’端时,通过5’端所含的同源碱基链转移到受体RNA上继续延伸,而链转移后的c DNA片段可通过凝胶电泳法进行分析。但该方法仅能检测由引物起始逆转录的c DNA片段,并且由于不能准确得到c DNA片段的序列,因此发生在片段内部的反方向和缺失性链转移都不能进行准确的分析。在第三个研究系统中,研究者是利用PCR方法扩增HIV基因组并对其产物进行测序,利用序列比对分析等方法检测病毒基因组缺失、插入和重组等现象来研究链转移。然而在这种方法中,大量由异常链转移作用产生PCR引物结合位点缺失的c DNA片段也同样不能用PCR方法扩增而被检测到。逆转录酶(RT)在逆转录病毒的复制、病毒RNA基因组和宿主m RNA基因组的研究中占据着重要的地位。然而由于以上三种传统的研究方法的缺陷,人们目前对逆转录酶的链转移机制、链转移频率、终止特性以及当c DNA片段逆转录至RNA 5’末端时的冗余碱基插入等机制以及对病毒复制的影响都没有深入的了解。因此,针对上述方法的缺陷,我们采用了一种全新的研究系统对链转移机制进行研究。我们分别利用逆转录病毒HIV-1,HIV-2和MLV的逆转录酶,用HIV-2和HAV的部分基因组RNA为模板进行逆转录反应,将逆转录合成的c DNA片段直接进行克隆并测序,并同得到的c DNA序列与原始模板序列进行比对。通过分析所得到的1067条c DNA的碱基序列,我们获得下述有关链转移机制的新发现:1、大多数逆转录片段都沿着RNA模板随机终止,其中72%的序列都与模板的原始序列完全匹配。另外28%的逆转录片段的3’端由于异常链转移产生与模板不匹配的序列。2、异常链转移序列在逆转录过程中与原始模板发生暂时分离,而在模板(RNA模板或c DNA模板)的异常位点匹配并继续延伸。3、93%的异常链转移序列都只含有一次链转移,但是少数逆转录片段会发生两次或者三次异常链转移。重要的是上述这些异常链转移大部分都发生在方向相反的模板上,因此利用传统的方法是检测不到的。4、逆转录过程中由逆转录酶导致的突变大大增加异常链转移发生的概率。5、HIV-2和MLV逆转录酶所导致的异常链转移率远远高于HIV-1逆转录酶所导致的异常链转移率。由于异常链转移的产生,导致大量缺陷病毒基因组的产生。这一现象说明HIV基因组在复制过程中精确性较差,同时也可能解释了为什么在自然感染过程中只有极少量病毒颗粒(0.1%)具有感染活性。相对于HIV-1,HIV-2的高异常链转移率可为该病毒在宿主体内较低病毒载量和导致相对缓慢的疾病发展过程提供理论依据。与此同时,我们对所有1067条c DNA序列的进一步分析发现逆转录片段经常不含有引物序列。它们其起始位点可发生在RNA模板的任何位置,并且这种起始并没有碱基嗜性和RNA二级结构特异性。上述结果表明逆转录酶在逆转录起始不仅使用特定核苷引物还可随机在RNA模板起始逆转录过程。由于本研究中直接对逆转录酶合成的逆转录片段进行克隆和序列分析,因此研究逆转录酶的突变率可不受高错误率PCR的影响。因此我们还利用本实验得到的逆转录序列测定了不同逆转录酶的突变率。结果显示,在该系统条件下HIV-1逆转录酶的突变率(2.9×10-3每个碱基每个复制周期)要远高于以往实验方法得到的突变率(3.4×10-5每个碱基每个复制周期)。这表明以往实验方法可能过低地估计了逆转录酶的突变率,并为进一步研究HIV基因组的高突变性提供依据。本文通过研究逆转录酶的持续合成能力,链转移,随机起始和高突变率等特性得到的新发现将为今后进一步对逆转录酶的生化特性以及逆转录病毒的复制,病毒生物学和致病性等奠定了基础。同时,本文的实验结果也为将来通过增加逆转录酶所固有的高异常链转移率这一特性作为新的药物靶点,进而为研制新型抗逆转录病毒感染的药物提供理论依据。