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研究目的:胡桃楸为胡桃科,胡桃属植物,在我国分布广泛,植物物种资源丰富,并且具有多种药理活性,其中抗肿瘤功效较为显著。在中国和韩国,胡桃楸未成熟外果皮已经应用在肿瘤等疾病的治疗中。胡桃醌(Juglone,JG)是一种广泛存在于胡桃揪新鲜根皮、枝皮和青果皮中的萘醌类成分。据报道,胡桃醌在体外对多种肿瘤均有抑制作用,但是JG诱导肝癌细胞凋亡和自噬的分子机制目前仍不清楚。因此,本研究以人肝癌HepG2细胞系为模型,利用分子生物学、细胞生物学及裸鼠移植瘤实验等技术手段,重点考察了自噬和凋亡在JG抑制肿瘤生长过程中的作用,并进一步探究JG诱导细胞自噬和凋亡的分子机制,以及自噬对JG抑制肝癌细胞生长的影响,为进一步以JG为基础研制开发抗肿瘤新药提供一定的科学依据。研究方法:在本研究中,利用MTT、CCK-8和克隆形成方法检测JG对肝癌HepG2细胞增殖抑制作用。通过流式细胞仪和周期相关蛋白探究JG对细胞周期的影响。应用倒置荧光显微镜观察JG处理后HepG2细胞以及细胞核的构型变化。并用DNA损伤、细胞凋亡、线粒体膜电位和凋亡相关蛋白等检测方法探讨JG对细胞凋亡的影响。应用AO染色、MDC染色、Ad-mCherry-GFP-LC3B转染、免疫荧光双染和western blotting研究JG对细胞自噬的影响,同时分别使用自噬抑制剂3-MA或wortmannin抑制自噬观察其对凋亡的影响。之后还检测了 JG诱导自噬激活的可能通路以及ROS的变化。最后通过建立裸鼠移植瘤观察JG在体内抗肿瘤的作用。研究结果:体外实验研究结果1.JG能够抑制HepG2细胞增殖并诱导细胞凋亡。与空白组相比,JG处理显著降低了 HepG2细胞的活力,呈时间和剂量依赖性,但对正常肝细胞表现出较低的毒性。同时JG处理减少了 HepG2细胞克隆的形成,并将细胞阻滞在G2/M期。光镜下发现JG干预后细胞体积缩小,细胞间间隙增大并且核中的染色质发生固缩。Annexin-V-FITC/PI双染结果显示细胞凋亡比例由4.08%(0 μM)增加至20.90%(30 μM)。免疫印迹结果进一步显示,cleaved PARP和cleaved caspase-3的表达随着JG浓度的增大而升高。同时,JG干预后引起细胞中p53的快速积累,然而采用siRNA沉默p53表达后,细胞凋亡明显减少。2.JG可以诱导HepG2细胞产生自噬。AO和MDC染色显示JG组的细胞分别出现更强的橘红色荧光和绿色荧光。Western blotting检测发现JG能够提高自噬相关蛋白LC3II、Beclin-1和Atg5的表达水平,而p62蛋白的表达量逐渐降低。然后,激光共聚焦显微镜观察发现JG可以诱导腺病毒mCherry-GFP-LC3转染的HepG2细胞中LC3的红色和绿色荧光亮点产生且二者不能完全重合,但是联合抑制剂CQ和Baf A1干预后,细胞中几乎全部为黄色荧光亮点。此外,用自噬抑制剂3-MA或wortmannin联合JG共同处理后,细胞内自噬小体减少。MTT和Annexin-V-FITC/PI结果进一步表明JG诱导的自噬可以增加细胞凋亡。3.JG可以诱导HepG2细胞自噬的相关通路激活。Western blotting检测表明细胞内p-p38 MAPK和p-JNK的表达水平升高,然而p-ERK1/2的表达没有变化。同时还发现蛋白AMPKα和ACC磷酸化水平也明显升高,但是p-mTOR蛋白表达量被抑制。抑制AMPK途径可以明显减少JG引起的自噬。此外,siRNA沉默p53同样也抑制了自噬的发生。4.JG能够诱导细胞中线粒体介导ROS产生。流式细胞仪检测发现JG时间和浓度依赖性降低细胞线粒体膜电位(MMP)。随着抗氧化剂NAC使用可以有效改善这一现象。同时,western blotting分析结果表明随着JG处理导致细胞中的Bax/Bcl-2比例显著升高。进一步研究发现,JG主要增加了细胞中的H2O2和O2·-水平。联合清除剂CAT或SOD共同作用细胞后,细胞凋亡比例出现一定程度的降低。Western blotting分析结果也表明H2O2的清除剂CAT和O2·-的清除剂SOD都能抑制JG诱导的p53积累和凋亡蛋白PARP和caspase-3激活。此外,激光共聚焦显微镜观察发现相比SOD,CAT能更显著地抑制腺病毒mCherry-GFP-LC3转染细胞中荧光亮点的产生。体内研究结果JG能够抑制裸鼠移植瘤的生长。与对照组相比,JG给药组裸鼠皮下移植瘤无论是肿瘤体积还是重量都显著减小,HE染色可见肿瘤组织有明显的坏死现象。同时western blotting及免疫组织化学结果表明JG组中自噬标志蛋白LC3II蛋白、凋亡相关蛋白cleaved caspase-3及p53表达增加。虽然JG组的裸鼠体重略有下降,但病理检测鼠体内重要脏器细胞结构并没有明显地变化。研究结论:JG具有显著的抗肿瘤活性,而且JG抑制人肝癌HepG2细胞增殖,促进细胞周期阻滞和凋亡,同时JG还能引起肝癌细胞自噬,抑制自噬可使JG诱导的细胞凋亡减弱。JG引起的自噬和凋亡都与细胞内的氧化应激水平的升高相关。在肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤模型中,JG能够有效抑制肿瘤的生长,且无明显的毒副作用。综上,本研究为JG临床应用提供一定的科学依据。