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百合(Lilium spp.)观赏品质优良,在世界花卉市场上占有重要地位,然而由病原真菌椭圆葡萄孢(Botrytis elliptica)和灰葡萄孢(B.cinerea)引起的灰霉病是百合生产中最主要的病害之一,前人从形态学、细胞学、生理生化等方面,探讨了百合对灰霉病的抗性机制。目前,有关百合响应灰霉菌侵染的分子机制研究相对薄弱,本研究利用高通量测序技术,从转录组学水平上探索了百合对灰霉菌胁迫的早期应答反应,挖掘了不同抗病反应通路中重要候选基因,重点对岷江百合LrWRKYs基因家族成员进行了序列进化、转录表达及功能验证研究,确定了具有抗灰霉病作用的LrWRKYs成员。主要研究结果如下:(1)选取对灰霉病高抗的岷江百合为试验材料,对接种B.elliptica Oh、4h、12 h、24h后的叶片组织进行转录组测序。共获得96,416条高质量的Unigene序列,其中47,719条(49.50%)Unigene获得了功能注释。四个样本的表达谱共获得了7,697个差异表达基因。与Oh相比,接种4h、12h及24h后均上调表达的基因有3,599个,下调表达的基因有2,261个。接种12h后产生的差异表达基因数量最多,并且上调表达基因数目大于下调表达基因数目。共鉴定出了42个抗灰霉病相关基因,部分基因参与Ca2+信号通路、ROS产生及清除系统、苯丙烷生物合成通路、JA生物合成及信号转导通路,另有部分基因编码类受体激酶(RLKs)、多酚氧化酶(PPO)以及不同转录因子(WRKY、MYB、NAC、ERF)和PR蛋白,大多数基因在接种4h后便出现表达量的显著增加。(2)检索岷江百合转录组数据库,共获得了 23个具有完整结构域的LrWRKYs基因家族成员,这些基因可划分为Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe和Ⅲ类,其中Ⅰ类WRKY蛋白成员具有2个保守的WRKY结构域和C2H2型(C-X4-C-X23-H-X1-H)锌指结构。Ⅱ类成员含1个WRKY结构域和C2H2型(C-X4-5-C-X23-H-X1-H)锌指结构。Ⅲ类成员含1个WRKY结构域和C2HC型(C-X7-C-X23-H-X1-C)锌指结构,同类LrWRKYs基因大致具有相类似的基序组成,多数成员的结构域含有保守的WRKYGQK序列,但LrWRKY6和LrWRKY7包含突变的WRKYGKK序列,分析LrWRKYs基因的功能注释发现它们可能参与生物和非生物胁迫响应。(3)在转录组中鉴定出6个显著上调表达的Lr WRKYs基因,包括Ⅰ类成员LrWRKY8和LrWRKY10,Ⅱa类的LrWRKY12,Ⅱc类的LrWRKY4、LrWRKY6和LrWRKY7。在岷江百合和感病材料’Yale’中这6个基因能够对B.elliptica迅速做出响应,侵染12h或24h后便可高表达;而这些基因在两种百合中对B.cinerea的反应相对滞后,侵染36h后才出现出表达量的显著增加。一些LrWRKYs基因表达量的高低同百合对灰霉病的抗性水平具有明显的相关性。Lr WRKY4和LrWRKY10在两种灰霉菌分别侵染下的岷江百合中表达量均高于’Yale’,而LrWRKY7则在两种灰霉菌侵染下的’Yale’中有较高表达。Lr WRKY6、LrWRKY8和LrWRKY12只在一种灰霉菌(B.elliptica或B.cinerea)侵染下的岷江百合中高表达。预测岷江百合中高表达的LrWRKY4、LrWRYY6、Lr WRKY8、LrWRKYl0和LrWRKY12在百合抗灰霉病中发挥积极作用。(4)从岷江百合中克隆得到Ⅱc类成员LrWRKY4和Ⅱa类成员LrWRKY12,亚细胞定位分析表明二者为核定位蛋白,并且这两个基因在岷江百合根、茎、叶和花中均有表达,但在根中表达量最高;外施SA和MeJA可促进它们的表达。在拟南芥中过表达Lr WRKY4可通过激活JA途径防御基因(AtLOX、AtMYC2和AtPDF1.2)的表达并抑制SA途径基因(AtPR1、AtPR2和AtPR5)的表达来增强转基因株系对B.cinerea的抗性,而LrWRKY12可同时增强SA和JA途径防御基因的表达以提高转基因拟南芥的抗病性,对比发现Lr WRKY4对抗性的增强效果更加显著,是灰霉病抗性反应中的重要促进因子。(5)建立了农杆菌介导的’回归’百合组培苗鳞片的遗传转化体系。MS+0.1mg.L-1 KT+O.1mg·L-1 NAA+30g-L-1蔗糖是鳞片较好的不定芽诱导培养基。MS+0.2mg.L-1 NAA+0.005mg·L-1 TDZ+30g·L-1 蔗糖和 MS+2.Omg·L-1 PIC+1.0mg-L-1 KT+1.Omg·L-1 ZT+30g·L-1蔗糖分别是组培苗鳞茎薄层切片较好的不定芽和愈伤组织诱导培养基。草丁膦浓度为0.8mg-L-1和0.4mg·L-1可分别作为鳞片和薄层切片在遗传转化中的筛选浓度。分别以组培苗小鳞片和鳞茎薄层切片为受体材料,通过农杆菌介导法转化LrWRKY4,结果显示以鳞片为受体材料效果较好,转化效率为2.08%;而薄层切片转化效率较低,并未获得转基因植株,不适合做’回归’转化的受体材料。通过鳞片分化获得的部分转基因株系对B.elliptica的抗性显著增强。以上研究结果对阐释岷江百合抗灰霉病的分子机理具有重要的理论意义,获得的’回归’转基因植株的获得对培育高抗性百合新品种具有重要的作用。