论文部分内容阅读
第一部分大鼠皮层神经元氧糖剥夺损伤后内质网应激相关凋亡的研究目的观察大鼠皮层神经元体外模拟缺血再灌注后神经元凋亡情况及内质网应激相关变化。方法体外培养SD大鼠乳鼠大脑皮层神经元,神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色法鉴定培养的神经元纯度,随机分为正常对照组及缺血再灌注模型组,采用氧糖剥夺法建立模拟缺血再灌注神经元模型。观察体外培养的神经元形态,采用流式细胞仪Annexin V-FITC、PI染色法检测细胞凋亡率,Hoechst33258染色后通过荧光显微镜观察神经元细胞核形态变化,Western-blot检测神经元GRP78. active caspasel2蛋白水平。结果体外培养SD大鼠乳鼠皮层神经元成功,神经元纯度在90%以上。模型组神经元在再灌注6h后凋亡增加不显著,但在12h、24h、48h均较正常对照组明显增加,并随着再灌注后时间的延长而逐渐上升。Hoechst33258染色可见凋亡细胞核致密浓染,荧光增强。模型组GRP78蛋白表达逐渐增多,在再灌注后24h最多,但在48h时GRP78蛋白表达反而有下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着再灌注时间的延长,active caspase12蛋白表达量逐渐增多,在48h时表达最多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论体外原代培养神经元采用氧糖剥夺损伤法,成功构建了模拟缺血再灌注模型,该模型可见神经元凋亡,内质网应激途径介导了神经元凋亡的发生。第二部分低分子肝素对大鼠皮层神经元内质网应激相关凋亡的影响目的观察低分子肝素对大鼠皮层神经元氧糖剥夺损伤后细胞凋亡的影响。方法体外培养SD大鼠乳鼠大脑皮层神经元,观察体外培养神经元形态,神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色法鉴定培养的神经元纯度。氧糖剥夺法建立模拟缺血再灌注神经元模型。随机分为正常对照组、缺血再灌注模型组(缺血6h/再灌注24h)及低分子肝素干预组(缺血建模前2h给药,分为0.1μg/ml、0.5μg/ml、2.5μg/ml、、5.0μg/ml组)。MTT法检测各组神经元光密度(0D)值、计算细胞活力、筛选最佳药物浓度。Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,Hoechst33258染色观察各组神经元细胞核形态变化。结果体外培养SD大鼠乳鼠皮层神经元成功,神经元纯度在90%以上。模拟缺血再灌注后神经元活力明显下降,细胞凋亡率显著增加,与正常对照组比较差异明显,具有统计学意义(P<0.01)。0.1μg/ml浓度低分子肝素组神经元活力与对照组比较无显著差异,而浓度为0.5μg/ml、2.5μg/ml/5.0μg/ml的低分子肝素组神经元活力均比缺血再灌注组显著增加,具有统计学意义(P<0.01)。Hoechst33258染色可见正常对照组细胞核呈弥散均匀蓝光,缺血再灌注组凋亡细胞核致密浓染,荧光增强,低分子肝素组凋亡细胞数量较缺血再灌注组明显减少。结论低分子肝素能提高体外培养神经元氧糖剥夺损伤后的细胞活力,可降低神经元凋亡,具有明显的神经保护作用。第三部分低分子肝素对大鼠皮层神经元内质网应激神经保护作用机制的研究目的研究低分子肝素对大鼠皮层神经元氧糖剥夺损伤后神经保护作用的机制。方法体外培养SD大鼠乳鼠大脑皮层神经元,观察体外培养神经元形态,神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色法鉴定培养的神经元纯度。氧糖剥夺法建立模拟缺血再灌注神经元模型。随机分为正常对照组、缺血再灌注模型组(缺血6h/再灌注24h)及低分子肝素干预组(缺血建模前2h给药,0.5mμg/ml)。Western-blot检测神经元bcl-2、 bax、 GRP78和active caspase12的蛋白水平。采用负载Fura-2/AM,双波长荧光分光光度计法测定神经细胞胞浆钙离子浓度[Ca2+]i。结果体外培养SD大鼠乳鼠皮层神经元成功,其纯度在90%以上。Western-blot结果显示：与对照组相比,模型组的bcl-2蛋白表达水平明显降低,bax表达水平明显升高,bcl-2/bax比值明显下降,结果具有显著性差异(P<0.01)；与模型组相比,低分子肝素组bcl-2蛋白表达水平有明显升高,bax蛋白表达有明显下降,bcl-2/bax比值明显升高,结果具有显著性差异(P<0.01)。与对照组相比,模型组GRP78蛋白表达水平明显升高,低分子肝素组GRP78蛋白表达水平最高,结果均具有明显差异(P<0.05)；与对照组相比,模型组active casase12蛋白表达水平明显升高,低分子肝素组active casase12蛋白表达水平明显降低,结果均具有明显差异(P<0.05)。钙离子浓度测定显示：模型组[Ca2+]i与对照组相比明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)；低分子肝素组[Ca2+]i较模型组明显下降,差异也有统计学意义(P<0.01)。结论低分子肝素对体外培养的大鼠皮层神经元模拟缺血再灌注损伤具有神经保护作用。其机制可能与提高bcl-2/bax比值,上调GRP78蛋白表达,降低active caspase12蛋白表达,降低神经元[Ca2+]i而抑制内质网相关凋亡有关。